專利名稱：生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種清除生物芯片雜交過程中的非特異鍵合探針的方法，尤其涉及一種生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法。
背景技術：
基因芯片是近年來在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術。所謂基因芯片就是按特定的排列方式固定有大量基因探針(寡核苷酸探針或cDNA探針)的硅片、玻片、塑料片?；蛐酒夹g是高效地大規(guī)模獲取相關生物信息的主要手段。目前，該技術應用領域主要有基因表達譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等。九十年代初以美國為主開始進行的各種生物芯片的研制，不到十年的功夫，芯片技術得以迅速發(fā)展，并呈現(xiàn)發(fā)展高峰。目前基因芯片的制備可以分成點樣制備和原位合成制備法。在基因芯片的使用方面，不管是通過固定的DNA核酸探針與標記的核酸之間的雜交來檢測目標核酸分子，還是先通過與固定的DNA核酸探針與核酸之間雜交，最后利用形成的雙鏈DNA來檢測蛋白質分子。最重要的是在固定的DNA核酸探針與核酸之間雜交后，核酸間雜交形成的完全正配的雙螺旋結構能夠給出最大的雜交信號，而核酸間雜交形成的錯配的雙螺旋結構和雜交剩余的標記靶序列希望能夠完全清除，給出最小的雜交信號，這樣方便有用信息的準確獲取。目前，非特異鍵合探針的清除通常采用兩種手段來實現(xiàn)對于與固定探針雜交構成堿基錯配的標記靶序列，則采用優(yōu)化雜交溫度，使其具有最少形成雙鏈結構的形式；對于雜交剩余的標記靶序列，采用緩沖液洗滌芯片的方法。很明顯，基因芯片的雜交檢測只能采用一個雜交溫度，由于芯片上具有成千上萬個固定的核酸探針分子，因此通過優(yōu)化滿足所有探針的雜交溫度是很困難的，有時甚至是不可能的，這樣，與堿基錯配序列雜交的標記靶序列探針就很可能給出較強的雜交信號，區(qū)分單堿基錯配序列變得困難，尤其對于雜交信號強度均勻性不太好的情況更是如此。而采用緩沖液洗滌芯片的方法對于玻璃、石英等硬質載體而言，由于載體吸附能力差，洗滌可以有效地清除雜交剩余的標記靶序列。但是對于凝膠等多孔載體，由于其多孔結構強烈吸附標記的靶序列而使檢測的背景噪音很高，導致分析結果的錯誤。上訴情況表明，采用目前的洗滌方法不能夠有效地清除非特異鍵合的靶序列，導致芯片檢測的數(shù)據(jù)不可靠。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種能夠提高檢測信號的識別能力且適用性廣的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法。
本發(fā)明采用如下技術方案一種用于清洗生物芯片的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，將雜交后的生物芯片浸于緩沖液中，并將該緩沖液置于電場中，電場將游離的帶負電荷的核酸分子移向電場正極，使非特異鍵合探針離開芯片進入電泳緩沖液中而被清除。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明能夠有效清除地芯片雜交后非特異鍵合探針，提高信噪比以及單堿基錯配的識別能力，使獲取的信息準確可靠。
本發(fā)明是在微陣列芯片雜交后用電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的洗滌過程。電泳過程中，雜交剩余的標記靶序列首先被有效清除。由于參與形成雙鏈結構的靶標物和自由靶標物之間存在動態(tài)平衡，在電泳不斷移走靶標物的情況下，參與雜交的靶標物會隨雙鏈的打開也被電泳移走。由于完全正配的雙鏈結構比錯配的雙鏈結構穩(wěn)定，這樣通過電泳，只有完全匹配序列才具有明顯的雜交信號，而錯配序列的雜交熒光信號則與背景相同且無關于錯配堿基數(shù)目的多少。通過電泳可以區(qū)分完全匹配的序列和單堿基錯配的序列。處理過程中，采用電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的洗滌方法來清除基因芯片雜交后的非特異鍵合探針更有效。因為核酸分子帶有負電荷，電泳過程中，沒有參與雜交的標記探針被首先清除，隨著電泳的繼續(xù)進行，標記探針與固定核酸分子雜交形成的雙鏈結構由于游離的標記探針在電泳下被移走，并衡被打破，使得雜交形成的雙鏈結構開始解鏈，由于完全正配得雙鏈結構比含有錯配堿基的雙鏈結構穩(wěn)定，只有完全匹配序列才具有明顯的雜交信號，而錯配序列的雜交熒光信號則與背景相同且無關錯配堿基數(shù)目的多少。通過電泳可以更有效區(qū)分完全匹配的序列和單堿基錯配的序列，可用于單堿基突變識別和SNP分型。由于該方法與目前廣泛使用的DNA芯片兼容，可以更準確和可靠地獲得檢測核酸、蛋白質等生物分子信息。
由于芯片上排列方式固定有大量基因探針，這些探針與靶序列雜交很多情況下無法保持相同的Tm值，因此選擇一個“優(yōu)化雜交溫度”并不適合芯片上所有的基因探針的雜交溫度，因而“優(yōu)化雜交溫度”的方式和雜交后緩沖液洗滌的傳統(tǒng)方法并不能有效的區(qū)別完全正配序列和單堿基錯配序列，尤其是雜交信號不均勻的情況下，這種區(qū)分難度更大。而采用電泳后處理的方法，不管基因探針的雜交溫度是否一致，采用常溫雜交將所有可能雜交的模式完成雜交，然后再通過控制電泳條件則可以很好地將完全正配序列和單堿基錯配序列實現(xiàn)有效的區(qū)分。


圖1是一種寡聚核苷酸微陣列的雜交熒光圖象。
圖2是一種寡聚核苷酸微陣列芯片的雜交熒光圖象。
圖3是一種cDNA微陣列芯片的雜交熒光圖象。
具體實施例方式
一種用于清洗生物芯片的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，將雜交后的生物芯片浸于緩沖液中，并將該緩沖液置于電場中，電場將游離的帶負電荷的核酸分子移向電場正極，使非特異鍵合探針離開芯片進入電泳緩沖液中而被清除，在本實施例中，電場電壓為1-600V，電流強度為1-100mA，例如電場電壓為520V、260V或90V，電流強度為15mA、50mA或90mA，最佳電場電壓為50-100V，電流強度為10-20mA，上述電場方向與芯片方向平行或垂直，探針為熒光標記的探針、化學發(fā)光標記的探針、酶標記的探針或者膠體金標記的探針中的一種。
(參照附圖1)一種寡聚核苷酸微陣列的雜通過電泳方法有效清除沒有參與雜交的標記靶序列提高信噪比。將丙烯酰胺修飾核酸通過和丙烯酰胺單體聚合形方法將核酸固定在玻璃片上制備的一種含寡聚核苷酸探針和聚丙烯酰胺凝膠(不含核酸的空白樣品)的微陣列。圖1是雜交后處理采用傳統(tǒng)洗滌和電泳方法的比較結果。圖中第3、4行是沒有寡核酸的3％聚丙烯酰胺凝膠，1、2行是含有1uM寡核苷酸的3％聚丙烯酰胺凝膠。圖1A是與互補熒光標記序列雜交后采用通常的洗滌方法得到的熒光掃描圖像。從采用強烈洗滌方式得到掃描圖可以看出這種方法不能有效的清除導致高的背景。第3、4行的平均熒光強度為48431和47105。第1、2行的平均熒光強度為55110和54349，這個強度幾乎等于背景(聚丙烯酰胺凝膠)的強度，其熒光強度的比值僅為1.14。這么強烈的熒光背景是不能被接受的，空白樣品不含有寡核酸自然不會與靶標物雜交因此不應具有熒光信號，造成這么強的熒光信號歸結為聚丙烯酰胺凝膠的強烈吸附作用。因此雜交后處理采用傳統(tǒng)的洗滌方式是不能有效地清除非特異鍵合的靶標記物的。圖1B是雜交后處理采用電泳方式得到的掃描圖。通過電泳非特異鍵合的靶標物被有效的清除，空白樣品的相對熒光強度也僅為981，而寡核酸的相對熒光強度則為24772，雖然寡核酸的相對熒光強度也降低了，但與空白樣品的比值則從1.14升至了25.3。通過電泳可以大大增加信(號)這樣便可以很清楚的一結果表明電泳能夠有噪(音)比，清除地知道樣品和空白。
(參照附圖2)一種寡聚核苷酸微陣列芯片雜交后采用電泳處理方法對寡聚核酸完全正配和堿基錯配的區(qū)分。具體如下將四種不同序列的寡聚核苷酸和不含核酸的空白樣品(例如，分別與Cy3顏料標記序列Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′完全正配，中央位置錯配1，2，3個堿基的序列5′-TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3′(P0)；5′-TCA ACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3′(P1)；5′-TCA ACA CAG CACGAT CAC TCA CAG CA-3′(P2)；5′-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3′(P3)制備成核酸陣列(下表帶下劃線的字母表示錯配堿基。分別表示P0，P1，P2，P3序列和不含核酸的空白樣品P的各10個寡核酸陣點構成寡核酸微陣列)。DNA微陣列芯片在常溫下與10uM的Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′序列雜交2小時，雜交完成后芯片置于常溫(24℃)或者50℃的1×TBE緩沖液中5V/cm條件下電泳30分鐘。用掃描儀掃描分別得到兩種電泳溫度下的雜交熒光圖象(圖2A和圖2B)。在圖1B中電泳不僅將沒有參與雜交的標記探針清除掉了，而且與含有錯配堿基探針雜交的標記探針也被完全除掉，因此只有完全匹配序列(P0)具有明顯的雜交信號，而錯配序列的雜交熒光信號則與背景相同；而在圖1A中電泳僅僅將沒有參與雜交的標記探針清除掉了，而且與含有錯配堿基探針雜交的標記探針沒有被完全除掉，因此只有完全匹配序列(P0)和錯配序列均具有相應的雜交信號，其錯配1，2，3個堿基的熒光強度分別為完全正配的51.9％，2.48％和0.899％。很明顯信號強度隨著堿基錯配數(shù)目的增加而下降很快，雖然該條件下也能區(qū)分正配和單堿基錯配序列，但顯然沒有圖2B中電泳條件下區(qū)分容易，尤其對于探針陣點信號強度序列均勻性不好情況下，圖1B的電泳條件更更容易區(qū)分正配和單堿基錯配序列。
(參照附圖3)一種cDNA微陣列芯片其雜交后采用電泳處理方法對氧化的低密度脂蛋白受體基因(Ox-LDL receptor 1 gene)14417位點的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析。三個已知14417位點多態(tài)性冠心病病人的新鮮血樣本經PCR后，由PCR產物固定得到相應的cDNA微陣列。cDNA微陣列芯片在常溫下與10uM的標記序列5′-Cy3-GGA AAA CAGCCA A-3′，5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3′序列雜交2小時，雜交完成后芯片置于常溫(24)1×TBE緩沖液中5V/cm條件下電泳8分鐘。掃描得到雜交熒光圖象(圖3)。通過雜交圖像三個樣本的基因型很容易被確定。純合子14417C/C給出強的CY3熒光信號(圖3A中4，5行，綠色熒光)。純合子14417G/G給出強的Cy5熒光信號(圖2B中7，8行，紅色熒光)。雜合型14417C/G即給出Cy3的熒光信號又同時給出Cy5的熒光信號(圖3A和圖3B中1，2行)，兩種染料疊加后，給出強的黃色熒光信號(圖3C中1，2行)。這個分型結果與傳統(tǒng)測序列的結果相一致(圖3D)。
權利要求
1.一種用于清洗生物芯片的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，其特征在于將雜交后的生物芯片浸于緩沖液中，并將該緩沖液置于電場中，電場將游離的帶負電荷的核酸分子移向電場正極，使非特異鍵合探針離開芯片進入電泳緩沖液中而被清除。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，其特征在于電場電壓為1-600V，電流強度為1-100mA。
3.根據(jù)權利要求2所述的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，其特征在于最佳電場電壓為50-100V，電流強度為10-20mA。
4.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，其特征在于電場方向與芯片方向平行或垂直。
5.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，其特征在于探針為熒光標記的探針、化學發(fā)光標記的探針、酶標記的探針或者膠體金標記的探針中的一種。
全文摘要
一種用于清洗生物芯片的生物芯片雜交中的非特異鍵合探針的電泳清除方法，將雜交后的生物芯片浸于緩沖液中，并將該緩沖液置于電場中，電場將游離的帶負電荷的核酸分子移向電場正極，使非特異鍵合探針離開芯片進入電泳緩沖液中而被清除。本發(fā)明能夠有效清除地芯片雜交后非特異鍵合探針，提高信噪比以及單堿基錯配的識別能力，使獲取的信息準確可靠。本發(fā)明是在微陣列芯片雜交后用電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的洗滌過程。電泳過程中，雜交剩余的標記靶序列首先被有效清除。由于參與形成雙鏈結構的靶標物和自由靶標物之間存在動態(tài)平衡，在電泳不斷移走靶標物的情況下，參與雜交的靶標物會隨雙鏈的打開也被電泳移走。
文檔編號C12Q1/68GK1766123SQ200510041508
公開日2006年5月3日 申請日期2005年8月17日 優(yōu)先權日2005年8月17日
發(fā)明者肖鵬峰, 陸祖宏, 程璐 申請人:東南大學