專利名稱：中國明對蝦抗脂多糖因子基因及其克隆方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗脂多糖因子，具體地說是一種中國明對蝦抗脂多糖因子基因及其克隆方法。
背景技術：
抗脂多糖因子(Anti-LPS factor，ALF)是最初發(fā)現(xiàn)于鱟(Limulus)體內(nèi)的一種具有抗菌活性和內(nèi)毒素結合活性的免疫因子。鱟是甲殼動物中免疫系統(tǒng)研究最多的動物之一。1964年Levin和Bang發(fā)現(xiàn)鱟血細胞溶解物能特異性地被LPS(lipopolysaccharide)激活而發(fā)生成膠反應。以后，從鱟細胞中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和分離出許多對內(nèi)毒素、細菌等有抑制或滅活作用的蛋白及多肽分子，包括外源性凝集素、凝固因子、LEBP-PI(Limulusendotoxin-binding protein-protease inhibitor)和LALF(Limulus Anti-LPSfactor)等，其中LALF是一種很重要的免疫相關因子。
Tanaka等于1982年從美洲鱟(Limulus polyphemus)體內(nèi)純化了LALF，此后測定了它的氨基酸序列并進行了一系列試驗，證明它具有抗內(nèi)毒素作用。LALF為單鏈的蛋白質分子，分子量約為11.5KD，由102個氨基酸組成，N端有20個高度疏水的氨基酸殘基，該蛋白在Cys32～Cys53間形成二硫鍵，正電荷殘基主要集中在二硫橋內(nèi)。研究表明用正電荷氨基酸取代二硫橋內(nèi)的中性或帶負電荷的氨基酸會提高LALF對LPS的結合能力，并能增強它的抗菌活性。此蛋白的pI值在10左右。LALF對革蘭氏陰性細菌，尤其是粗糙型菌具有強烈抑制作用，已證明LALF能夠結合LPS的類脂A部位并在體外中和LPS的生物學活性。如以LALF與LPS事先溫育則可顯著地降低LPS對大鼠的致死活性，并可顯著降低腦膜炎球菌LPS對家兔的毒性反應。近來的研究很多是針對LALF的LPS中和活性和抗菌活性而進行的，研究最多的是LALF35-52的環(huán)肽部分，因為此結構被認為是LPS的結合與活性中和功能域，此部位與LPS結合后可以阻止整個炎癥細胞因子級聯(lián)反應的原始刺激。Vallespi等研究發(fā)現(xiàn)，合成的環(huán)肽LALF31-52有助于保護小鼠免受內(nèi)毒素的攻擊，能夠在體外調(diào)節(jié)細胞因子的分泌。在研究革蘭氏陰性細菌引起的腹膜膿血癥模型時發(fā)現(xiàn)，用LALF31-52預處理小鼠可消除系統(tǒng)TNF-α反應，減少組織損傷，提高感染小鼠的存活率(參見Vallespi M.G.，Alvarez-Obregon J.C.，Rodriguez-Alonso I.，Montero T.，Garay H.，etal.A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokinegene expression and promotes resohtion of bacterial acute infectionin mice.International Immunopharmacology，2003，3247-256.)。故此LALF31-52被認為具有免疫調(diào)控的功能，對急性細菌感染和膿血癥的預防與治療有重要意義，尤其可以防止或改善上述疾病情況下的免疫失調(diào)。Paus等根據(jù)天然LALF氨基酸序列合成的基因成功地在酵母中表達了一種有活性的蛋白，并稱之為內(nèi)毒素中和蛋白(rENP)。對rENP的研究發(fā)現(xiàn)，它與陽離子抗菌蛋白有很多相似之處，例如它所表現(xiàn)出的對革蘭氏陰性及陽性細菌的毒性，以及其具有的LPS和肝素結合序列。rENP的肝素結合區(qū)位于半胱氨酸環(huán)內(nèi)，與LPS的結合位點相同(參見Paus，E.J.，Willey，J.，Ridge，R.J.，Legg，C.R.，F(xiàn)inkelman，M.A.，Novitsky，T.J.，Ketchum，P.A.Production of recombinant endotoxin neutralizing protein inPichia pastoris and methods for its purification.Protein Expressionand Purification.2002，26202-210)。
和其他抗菌肽一樣，抗脂多糖因子的作用機理與傳統(tǒng)抗生素不同，它的靶位點主要是病原體細胞膜，因此不易產(chǎn)生抗藥性。在目前許多病原菌對現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生抗藥性，而新的抗生素的發(fā)現(xiàn)極其困難的情況下，抗脂多糖因子為開發(fā)新的抗菌藥物開辟了廣闊的前景。總之，抗脂多糖因子以及其他類型抗菌肽的研究不僅在理論上具有重要意義，而且在實踐上具有巨大的應用潛力，因此，它已成為當今生物醫(yī)藥研究的熱點之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈式反應(Nested-PCR)、3’端cDNA快速擴增(3’-RACE)以及5’端cDNA快速擴增(5’-RACE)的方法，對中國明對蝦抗脂多糖因子基因進行了研究，首次從中國明對蝦中克隆到了一種抗菌活性較強的免疫因子抗脂多糖因子基因，用于抗脂多糖因子基因的重組表達和基因轉移，并為對蝦病防治和進一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品奠定基礎。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下中國明對蝦抗脂多糖因子基因具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其克隆方法(1)從中國明對蝦的血細胞中提取總RNA；(2)然后進行cDNA第一鏈合成；(3)根據(jù)中國明對蝦EST序列設計引物進行PCR反應，得到對蝦抗脂多糖因子基因片段，正向引物F15’GCACGAGGGAGCTTCATATT 3’，反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’；(4)又用一條特異性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA3’，進行cDNA3’末端快速擴增3’RACE；(5)然后用兩條反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’和R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’，利用5’RACE進行抗脂多糖因子cDNA5’末端快速擴增；(6)最后通過拼接3’RACE和5’RACE所得結果獲得全長基因片斷。
另外，所述引物還可以為序列列表中SEQ ID NO.1堿基序列片斷。
本發(fā)明有如下優(yōu)點1.采用本發(fā)明中所述方法，能夠從中國明對蝦血細胞中克隆到1種抗脂多糖因子基因(稱為中國明對蝦抗脂多糖因子基因)，采用本發(fā)明對對蝦抗脂多糖因子基因的成功克隆和測序，首次搞清了它的全部編碼序列和非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設計引物再克隆該基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根據(jù)該序列或該序列所推導的氨基酸序列對該基因進行重組表達或基因轉移。
2.通過網(wǎng)上相似性和同源性檢索，提示對蝦抗脂多糖因子可以抑制革蘭氏陰性細菌生長，具有中和內(nèi)毒素的作用。采用本發(fā)明使通過生物工程手段提高對蝦抗病能力，阻止由某些病原微生物引起的對蝦疾病的大規(guī)模爆發(fā)成為可能，從而能大大促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)。另外本抗脂多糖因子與病原微生物的作用不會引起抗藥性，有很大的藥用開發(fā)的前景。
3.意義深遠。通過本發(fā)明可深入了解對蝦免疫機制，發(fā)現(xiàn)新型免疫marker，為對蝦抗病品系選育以及防治對蝦細菌性疾病提供依據(jù)。由于海洋生物的特殊性，海洋藥物的開發(fā)已初具規(guī)模，對蝦抗菌活性物質的研究有望為藥物的開發(fā)和利用提供新的思路。
具體實施例方式
實施例1.一種克隆的中國明對蝦抗脂多糖因子基因，具有如下序列同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度615堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)(2)SEQ ID NO.2的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度123氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型肽序列描述SEQ ID NO.1
1TCG GCA CGA GGG AGC TTC ATA TTT TAG AAG ATG CGA GTT TCC GTG45M R V S V 546 TTG GCA AGC CTG GTG CTG GTG GTG TCC CTG GTG GCA CTC TTC GCC906 L A S L V L V V S L V A L F A 2091 CCG CAG TGC CAG GCT CAA GGG TGG GAG GCT GTG GCA GCG GCC GTC13521P Q C Q A Q G W E A V A A A V 35136 GCC GTC AAG ATT GTT GGG CTG TGG AGG AAC GAG AAA ACC GAA CTC18036A V K I V G L W R N E K T E L 50181 CTC GGC CAC GAG TGC AAG TTC ACC GTC AAG CCT TAC ATT AAG AGG22551L G H E C K F T V K P Y I K R 65226 TTC CAG TTG TAC TAC AAG GGG AGG ATG TGG TGC CCA GGC TGG ACG27066F Q L Y Y K G R M W C P G W T 80271 GCC ATC AGA GGA GAA GCC AAA ACA CGC AGT CGG TCC GGG GTG GCT31581A I R G E A K T R S R S G V A 95316 GGA AGG ACA GCC AAA GAC TTC GTC CGG AAA GCT TTC CAG CAA GGT36096G R T A K D F V R K A F Q Q G 110361 CTC ATC TCT CAA CAG CAG GCT AAC CAG TGG CTT AAC TCA TAG GCC405111 L I S Q Q Q A N Q W L N S406 CTT TGC TCT ATG AAG AAT TAC CAT TTG GAT CTC TTG TGT GAA GGC450451 ATT CAT TAT GTT AAA TTT TTG CTG TAC ACA AAA TAC TAT ATC AAA495496 AAC TTG TTA TAA TCT GTC TTA GAA GGA TTC TTA GAC TCT GCT GTC540541 ATT AAC CTA CAA TAA ATT CTT TGG AAT GTG ACG GAT ATT AGT AAA585586 CAA CTG TTG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 615序列描述SEQ ID NO.25 15 25 35 4555MRVSVLASLV LVVSLVALFA PQCQAQGWEA VAAAVAVKIV GLWRNEKTEL LGHECKFTVK65 75 85 95105 115PYIKRFQLYY KGRMWCPGWT AIRGEAKTRS RSGVAGRTAK DFVRKAFQQG LISQQQANQWLNS實施例2.中國明對蝦抗脂多糖因子基因的克隆方法1.總RNA提取用注射器從中國明對蝦第一腹節(jié)基部腹竇取血淋巴，并加入等體積抗凝劑(27mM sodium citrate，336mM NaCl，115mM glucose，9mM EDTA，pH7；Rodriguez et al.，1995)。血淋巴在4℃，800g離心10min，收集血細胞用于RNA的提取?？俁NA的提取使用上海博星生物公司的Unizol RNA提取試劑，提取方法參照使用說明書。
2.cDNA第一鏈合成據(jù)上海生工生物工程技術服務有限公司cDNA合成試劑盒說明書進行。
3.對蝦抗脂多糖因子cDNA片段克隆(1)根據(jù)cDNA文庫大規(guī)模測序所得EST序列設計引物，用于PCR擴增，得到對蝦抗脂多糖因子基因片段。
正向引物F15’GCA CGA GGG AGC TTC ATA TT3’，反向引物R15’GAG CAAAGG GCC TAT GAG TTA3’，聚合酶鏈式反應(PCR)的試劑與條件10xTaq DNA聚合酶緩沖液5μl模板 cDNA 1μlMgCl2 4μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脫氧核苷酸混合物(dNTP)4μlExTaq DNA聚合酶 0.25μl滅菌水33.75μlPCR反應程序為94℃預變性4min，然后進入下列循環(huán)94℃ 40s，57℃45s，72℃ 60s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(2)反應產(chǎn)物純化利用德國QIAGEN公司產(chǎn)品(QIAquick GelExtraction Kit)，操作步驟按產(chǎn)品說明書進行。
(3)基因片斷的克隆純化的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接，轉化TOP 10菌株，進行藍白斑篩選，挑取單克隆白斑擴增培養(yǎng)后，提取質粒，以F2、R2為引物做PCR檢測，確認插入片段大小后進行測序。
4.抗脂多糖因子cDNA 3’端快速擴增(3’-RACE)根據(jù)得到的抗脂多糖因子基因片段序列，又設計一條特異性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA 3’，進行cDNA 3’端快速擴增，操作步驟按寶生物3’-RACE試劑盒說明書進行。
取血細胞總RNA約20μg，其他試劑的配制和反應條件按說明書進行。用特異性引物F2與3’接頭引物AOLP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16(A/C/G) 3’，進行3’端PCR擴增，采用55℃退火，其余與上述的PCR擴增程序相同，對所得產(chǎn)物按前述方法進行克隆、驗證和測序。
5.抗脂多糖因子cDNA 5’端快速擴增(5’-RACE)(1)第一鏈cDNA合成以RNA為模板，R1為引物進行反轉錄得到第一鏈cDNA。反應體系為20μl無RNase水9μl，1.5μg/μl DNase處理過的總RNA 2μl，10pmol/LAp1引物1μl，5×反轉錄酶buffer 4μl，10pmol/μL dNTPs 2μl 40U/μlRNase inhibitor 1μl，200U/L M-MLV Reverse Transcriptase 1μl。反應條件先將無Rnase的超純水、RNA和引物加入薄壁管，70℃ 6min使RNA變性，冰上放置5min。然后依次加入反轉錄buffer、dNTPs、RNase inhibitor和反轉錄酶，42℃溫浴2h，95℃ 5min使反轉錄酶失活。
(2)加尾
反轉錄產(chǎn)物用ConcertTM Rapid PCR Purification System純化，除去未結合引物及酶。純化后的cDNA用TdT酶(Promega公司產(chǎn)品)和dATP加尾，連接dA多聚核苷酸，方法參考試劑盒說明書。
(3)第一輪PCR擴增模板用上述加尾cDNA，正向引物為AOLP，逆向引物為R1，其余試劑與上述PCR反應相同。反應條件為94℃4分鐘，然后進入下列循環(huán)94℃ 40s，55℃ 45s，72℃ 60s，25個循環(huán)，最后72℃延伸10min；(4)嵌套式PCR以20倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進行第二輪擴增，正向引物為AP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’，逆向引物為R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’。反應體系同前，反應條件采用Touchdown程序1個循環(huán)，94℃，4min；10個循環(huán)94℃ 40s，65℃，30s(每個循環(huán)溫度降低0.5℃)，72℃ 60s；25個循環(huán)94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 60s；最后72℃延伸10min(5)反應產(chǎn)物純化、克隆和測序同前。
6.抗脂多糖因子cDNA序列驗證根據(jù)拼接得到的對蝦抗脂多糖因子cDNA全序列的5’和3’端特異性序列，設計1對特異性引物進行全長序列擴增，再測序驗證。
通過網(wǎng)上相似性和同源性檢索，提示對蝦抗脂多糖因子可以抑制革蘭氏陰性細菌生長，具有中和內(nèi)毒素的作用。抗脂多糖因子的分子量較小，不會引起人體產(chǎn)生免疫反應，不會引起抗藥性，有很大的藥用開發(fā)的前景，或者用于對蝦病的防治。
另外，所述引物(F1，F(xiàn)2，R1和R2)還可以采用序列列表中SEQID NO.1堿基序列片斷。
多糖因子SEQUENCE LISTING<110>中國科學院海洋研究所<120>中國明對蝦抗脂多糖因子基因及其克隆方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>615<212>DNA<213>中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)<220>
<221>mRNA<222>(1)..(615)<223>
<220>
<221>CDS<222>(31)..(399)<223>
<400>1tcggcacgag ggagcttcat attttagaag atg cga gtt tcc gtg ttg gca agc54Met Arg Val Ser Val Leu Ala Ser1 5ctg gtg ctg gtg gtg tcc ctg gtg gca ctc ttc gcc ccg cag tgc cag102Leu Val Leu Val Val Ser Leu Val Ala Leu Phe Ala Pro Gln Cys Gln10 15 20gct caa ggg tgg gag gct gtg gca gcg gcc gtc gcc gtc aag att gtt150
多糖因子Ala Gln Gly Trp Glu Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Val Lys Ile Val25 30 35 40ggg ctg tgg agg aac gag aaa acc gaa ctc ctc ggc cac gag tgc aag198Gly Leu Trp Arg Asn Glu Lys Thr Glu Leu Leu Gly His Glu Cys Lys45 50 55ttc acc gtc aag cct tac att aag agg ttc cag ttg tac tac aag ggg246Phe Thr Val Lys Pro Tyr Ile Lys Arg Phe Gln Leu Tyr Tyr Lys Gly60 65 70agg atg tgg tgc cca ggc tgg acg gcc atc aga gga gaa gcc aaa aca294Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr Ala Ile Arg Gly Glu Ala Lys Thr75 80 85cgc agt cgg tcc ggg gtg gct gga agg aca gcc aaa gac ttc gtc cgg342Arg Ser Arg Ser Gly Val Ala Gly Arg Thr Ala Lys Asp Phe Val Arg90 95 100aaa gct ttc cag caa ggt ctc atc tct caa cag cag gct aac cag tgg390Lys Ala Phe Gln Gln Gly Leu Ile Ser Gln Gln Gln Ala Asn Gln Trp105 110 115 120ctt aac tca taggcccttt gctctatgaa gaattaccat ttggatctct439Leu Asn Sertgtgtgaagg cattcattat gttaaatttt tgctgtacac aaaatactat atcaaaaact 499tgttataatc tgtcttagaa ggattcttag actctgctgt cattaaccta caataaattc 559tttggaatgt gacggatatt agtaaacaac tgttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 615<210>2<211>123<212>PRT<213>中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)<400>2Met Arg Val Ser Val Leu Ala Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Val1 5 10 15Ala Leu Phe Ala Pro Gln Cys Gln Ala Gln Gly Trp Glu Ala Val Ala20 25 30Ala Ala Val Ala Val Lys Ile Val Gly Leu Trp Arg Asn Glu Lys Thr35 40 45Glu Leu Leu Gly His Glu Cys Lys Phe Thr Val Lys Pro Tyr Ile Lys50 55 60Arg Phe Gln Leu Tyr Tyr Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr65 70 75 80
多糖因子Ala Ile Arg Gly Glu Ala Lys Thr Arg Ser Arg Ser Gly Val Ala Gly85 90 95Arg Thr Ala Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala Phe Gln Gln Gly Leu Ile100 105 110Ser Gln Gln Gln Ala Asn Gln Trp Leu Asn Ser115 120
權利要求
1.一種中國明對蝦抗脂多糖因子基因，其特征在于具有序列表中SEQID NO.1堿基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一種按照權利要求1所述中國明對蝦抗脂多糖因子基因的克隆方法，其特征在于(1)從中國明對蝦的血細胞中提取總RNA；(2)然后進行cDNA第一鏈合成；(3)采用下列引物進行PCR反應，得到對蝦抗脂多糖因子基因片段，正向引物F15’GCACGAGGGAGCTTCATATT 3’，反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’；(4)又用一條特異性正向引物F25’GCTGTGGAGGAACGAGAAA3’，進行cDNA 3’端快速擴增3’RACE；(5)然后用兩條反向引物R15’GAGCAAAGGGCCTATGAGTTA 3’和R25’GCGTGTTTTGGCTTCTCCT 3’，利用5’RACE進行對抗脂多糖因子cDNA 5’端克??；(6)最后通過拼接3’RACE和5’RACE所得結果獲得全長基因片斷。
3.按照權利要求2所述中國明對蝦抗脂多糖因子基因的克隆方法，其特征在于步驟(3)(4)(5)中所述引物還可以為序列表中SEQ ID NO.1堿基序列片斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗脂多糖因子，具體地說是一種中國明對蝦抗脂多糖因子基因及其克隆方法；它具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；克隆方法包括1)從中國明對蝦的血細胞中提取總RNA；2)進行cDNA第一鏈合成；3)利用3’－RACE和5’－RACE克隆得到對蝦抗脂多糖因子基因。本發(fā)明首次從中國明對蝦血細胞中克隆到了1種抗脂多糖因子，搞清了它的全部編碼序列和非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，使通過生物工程手段阻止由某些病原微生物引起的對蝦疾病的大規(guī)模爆發(fā)成為可能，為對蝦，甚至人類的抗菌藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。
文檔編號C12N15/10GK1740320SQ200410050330
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權日2004年8月27日
發(fā)明者相建海, 柳峰松, 李富花, 董波 申請人:中國科學院海洋研究所