專(zhuān)利名稱(chēng)：飲用水中大腸桿菌快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飲用水水質(zhì)研究、水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種飲用水大腸桿菌的分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
飲用水的微生物學(xué)指標(biāo)與人們的健康息息相關(guān)，是飲用水水質(zhì)檢測(cè)十分關(guān)注的指標(biāo)。目前普遍采用的飲用水微生物檢測(cè)方法包括直接計(jì)數(shù)(顯微計(jì)數(shù))法、活菌計(jì)數(shù)(ColonyForming Units，CFU)法以及最可能數(shù)(MPN)法等，這些方法對(duì)控制飲用水的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)發(fā)揮了巨大的作用。但傳統(tǒng)檢測(cè)方法不可避免的會(huì)存在一定的缺陷(1)由于種種原因(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等)，現(xiàn)在可培養(yǎng)的微生物還不到微生物總數(shù)的1％，使得檢測(cè)結(jié)果頗不準(zhǔn)確。例如多管發(fā)酵法(MUG)很難檢測(cè)到E.coli 0 157H7；(2)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，至少需要48h，根本不能滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)水傳疾病快速發(fā)現(xiàn)、快速檢測(cè)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，建立了飲用水大腸桿菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明的反應(yīng)引物上游引物5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’下游引物5’-taa tcg a ta tac ccg ctc-3’用PCR方法檢測(cè)大腸桿菌，包括以下幾個(gè)步驟水樣中微生物的收集、微生物基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物觀察等四個(gè)步驟。
1、水樣中微生物的收集及采用滅菌后的濾膜或?yàn)V器過(guò)濾水樣，在裝有無(wú)菌水的EP管中，洗滌濾膜，離心，棄上清液，備用；2、樣中微生物基因組DNA的提取A、向上述EP管中加入TE緩沖液，使之重懸；B、加入SDS和蛋白酶K，混勻，溫育45min～1h；C、加入氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；D、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；E、加入異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，離心；F、棄上清，沉淀物用乙醇洗滌，晾干；G、將沉淀重溶于TE緩沖液，搖勻；H、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA模板的OD值，計(jì)算其DNA濃度，計(jì)算方法為DNA濃度(μg/μL)＝OD值260nm×樣品稀釋倍數(shù)×50/1000J、將基因組DNA模板做好標(biāo)記，貯存，備用；3、PCR擴(kuò)增；50μL反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 5μLTag酶 2U/μL1μLMgCl2(25mM) 5μLdNTP(2.5mM) 5μLddH20 29μL上游引物10μM 2μL上游引物10μM 2μL模板DNA 1.5μg/μL1μL4、產(chǎn)物觀察A、凝膠的準(zhǔn)備先配置瓊脂糖溶液，加熱，使其充分溶解，再加入溴化乙錠溶液；B、配置TAE電泳液；C、倒膠將配置好的瓊脂糖溶液倒入膠板中，待其凝固后，放入電泳槽中；D、電泳將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物與緩沖液按比例混合，加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，接通電源，設(shè)定電壓和電流，開(kāi)始電泳。
E、觀察；將擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外光下觀察，拍攝圖片。
采用上述飲用水大腸桿菌生物分子學(xué)檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法相比，時(shí)間短，從水樣送到實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始到檢測(cè)完畢，大約需要4～5個(gè)小時(shí)；靈敏度高，可以檢測(cè)到1～10個(gè)大腸桿菌/mL水樣。而傳統(tǒng)檢測(cè)方法至少需要48h。


圖1和圖2是水樣PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖象圖中1 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2-15 均為水樣微生物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體實(shí)施方式
以下以重慶市市政管網(wǎng)的15個(gè)水樣為例，詳細(xì)說(shuō)明本方法的具體實(shí)施過(guò)程第一步水樣中微生物的提取1 我國(guó)的飲用水水質(zhì)指標(biāo)規(guī)定，飲用水中大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)為＜1個(gè)/100mL，因此取水樣100mL。
2 濾膜和濾器的滅菌和安裝。濾器用高壓蒸汽121℃滅菌20min。用無(wú)菌的鑷子夾取已經(jīng)滅菌的0.22μm濾膜的邊緣，粗糙面向上，貼放在滅菌濾床上。
3 將100mL水樣注入濾器中，加蓋，打開(kāi)濾器閥門(mén)，在負(fù)50KPa下抽濾。
4 用酒精棉球擦拭剪刀，用無(wú)菌鑷子夾取濾膜邊緣，將濾膜用剪刀剪成寬0.5mm的細(xì)條，放入裝有2.5mL無(wú)菌水的EP管中，輕輕搖動(dòng)EP管，洗滌濾膜。
5 將EP管15000r/m離心5分鐘，棄上清，備用。
第二步提取水樣中微生物的基因組DNA微生物基因組DNA的提取方法1 藥品EDTA、I mol/L Tris-Cl、TE緩沖液(100m mol/L Tris-Cl，10m mol/L EDTA，4℃貯存)、10％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)、5mol/L NaCl、LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(4℃貯存)，上述試劑均需高壓滅菌；20mg/mL蛋白酶K(分成單次使用的小份貯存于-20℃)、24∶1氯仿/異戊醇、25∶24∶1酚/氯仿/異戊醇、異丙醇、70％乙醇2 設(shè)備和器材PTC-100型PCR儀、PB-20型pH計(jì)、ME 215S電子天平、TGL-15G高速臺(tái)式離心機(jī)、生化培養(yǎng)箱1臺(tái)、OD260和OD280紫外分光光度計(jì)1臺(tái)、冰箱1臺(tái)、水浴鍋1臺(tái)、高壓消毒鍋1臺(tái)、1000μL可調(diào)移液槍1個(gè)、200μL可調(diào)移液槍1個(gè)、10μL可調(diào)移液槍1個(gè)、10μL、200μL和5000μL移液槍頭若干、培養(yǎng)皿20個(gè)、一次性塑膠手套若干、EP管及PCR管若干、20L酸缸1個(gè)3 器皿處理方法所有的玻璃器皿在使用前，均用重鉻酸鉀洗液浸泡6小時(shí)以上，然后依次用自來(lái)水、蒸餾水、超純水沖洗干凈，晾干，然后消毒備用。EP管及PCR管等為一次性使用，高壓消毒后備用。
4 操作步驟取一株大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和狀態(tài)，取1.0mL的培養(yǎng)物于EP管中，12000轉(zhuǎn)/min離心2min。
棄上清，沉淀物加入567μL的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30μL10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育45min～1h。
加入等600μL的氯仿/異戊醇，混勻，12000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中。
加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中。
加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，5000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘。
棄上清，沉淀物用1mL的70％乙醇洗滌，晾干。
將沉淀重溶于100μL的TE緩沖液，搖勻。
用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA模板的OD值，從而計(jì)算其DNA濃度。計(jì)算方法為DNA濃度(μg/μL)＝OD值260nm×樣品稀釋倍數(shù)×50/1000將基因組DNA模板做好標(biāo)記，4℃條件下貯存，備用。
按上述方法提取微生物的基因組DNA作為模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
第三步PCR擴(kuò)增50μL反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 5μLTag酶 2U/μL1μLMgCl2(25mM) 5μLdNTP (2.5mM) 5μLddH20 29μL上游引物 10μM 2μL上游引物 10μM 2μL模板DNA 1.5μg/μL1μL本方法應(yīng)用分子生物學(xué)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)引物上游引物5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’下游引物5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’第三步產(chǎn)物觀察1 所需的試劑和器材DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp)、瓊脂糖粉、溴化乙錠(10mg/mL)溶液、Tris、EDTA、冰乙酸、電腦多用電泳儀、膠模、微波爐、1000mL玻璃瓶2個(gè)、500mL磨口三角燒瓶1個(gè)、1000mL量筒1個(gè)、一次性手套若干；2 凝膠的準(zhǔn)備。先配置1.5％瓊脂糖溶液，在微波爐中加熱，使其充分溶解，不要有顆粒物質(zhì)，以免影響產(chǎn)物的觀察。按2.0μL溴化乙錠溶液15mL瓊脂糖溶液的比例向瓊脂糖溶液中加入溴化乙錠。溴化乙錠的作用是使擴(kuò)增的DNA染色，以便在紫外燈下觀察。溴化乙錠有劇毒，因此所有接觸溴化乙錠的操作必須帶手套。
3 TAE電泳液的配置。稱(chēng)量4.84g Tris、2mL0.5mol/LEDTA、1.14mL冰乙酸，定容到1000mL，一般需配置2000mL電泳液。
4 倒膠。將配置好的瓊脂糖溶液倒入膠板中，待其凝固后，放入電泳槽中。
5 電泳。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物與緩沖液按1∶1的比例混合，加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker，試劑盒中自帶)，接通電源，設(shè)定電壓和電流，開(kāi)始電泳。
6 觀察。將擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外光下觀察，拍攝圖片。
本申請(qǐng)人利用本發(fā)明方法，共檢測(cè)了15個(gè)水樣，水樣2-8取自自來(lái)水龍頭水；水樣9-12取自市政二次管網(wǎng)貯水池中的貯存水，貯水時(shí)間約為24小時(shí)；水樣13-15取自水廠的清水池。各水樣大腸桿菌PCR法的檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1和圖2表明，用PCR法檢測(cè)飲用水的大腸桿菌，水樣2、5-8、9-12大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，水樣3-4、13-15大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求
1.飲用水中大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)水樣中微生物的收集及其DNA的提取采用滅菌后的濾膜或?yàn)V器過(guò)濾水樣，在裝有無(wú)菌水的EP管中，洗滌濾膜，離心，棄上清液，備用；(2)水樣中微生物DNA的提取A、向EP管中加入TE緩沖液，使之重懸；B、加入SDS和蛋白酶K，混勻，溫育45min～1h；C、加入氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；D、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新EP管中；E、加入異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，離心；F、棄上清，沉淀物用乙醇洗滌，晾干；G、將沉淀重溶于TE緩沖液，搖勻；H、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA模板的0D值，計(jì)算其DNA濃度，計(jì)算方法為DNA濃度(μg/μL)＝OD值260nm×樣品稀釋倍數(shù)×50/1000I、將基因組DNA模板做好標(biāo)記，貯存，備用；(3)PCR擴(kuò)增；反應(yīng)引物上游引物5’-tgt tca gtg gca aga gtt -3’下游引物5’-taa tcg a ta tac ccg ctc -3’50μL反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 5μLTag酶 2U/μL 1μLMgCl2(25mM) 5μLdNTP (2.5MM) 5μLddH20 29μL上游引物 10μM 2μL上游引物 10μM 2μL模板DNA 1.5μg/μL 1μL(4)產(chǎn)物觀察A、凝膠的準(zhǔn)備先配置瓊脂糖溶液，加熱，使其充分溶解，再加入溴化乙錠溶液；B、配置TAE電泳液；C、倒膠將配置好的瓊脂糖溶液倒入膠板中，待其凝固后，放入電泳槽中；D、電泳將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物與緩沖液按比例混合，加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，接通電源，設(shè)定電壓和電流，開(kāi)始電泳。E、觀察；將擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外光下觀察，拍攝圖片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種飲用水大腸桿菌的快速檢測(cè)方法。應(yīng)用分子生物學(xué)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用PCR方法檢測(cè)大腸桿菌，包括以下幾個(gè)步驟水樣中微生物的收集、微生物基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物觀察。采用上述方法與傳統(tǒng)方法相比，時(shí)間短，從水樣送到實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始到檢測(cè)完畢，大約需要4～5個(gè)小時(shí)；靈敏度高，可以檢測(cè)到1～10個(gè)大腸桿菌/mL水樣。而傳統(tǒng)檢測(cè)方法至少需要48h。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1563422SQ20041002232
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者龍騰銳, 馬穎, 方振東, 周從直 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)