專利名稱：甲烷的厭氧氧化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于將甲烷轉(zhuǎn)化成氫或氫等價(jià)物的厭氧生物學(xué)方法。此外，該發(fā)明涉及將含硫化合物還原為硫化物的生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
氧氣存在下生物的甲烷氧化在自然環(huán)境和工業(yè)用途中是一種沿用已久的方法。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在深海條件下古細(xì)菌(archaea)和硫酸鹽還原細(xì)菌的聚集體能夠進(jìn)行甲烷氧化(Boetius等，Nature，407623-626(2000)，Hoehler等，Global Biogeochemical Cycles，8451-563(1994))。然而，沒有純的或限定的微生物的培養(yǎng)物被人們所知能夠進(jìn)行厭氧性甲烷氧化(Orphan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)，99，7663-7668)。因此，甲烷的厭氧氧化沒有被很好地了解并且沒有在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用。古細(xì)菌(archaea)在工業(yè)過程中的使用幾乎是不可行的，如果是這樣的話，全然是由于它們非常低的生長速率。
硫氧化物化合物如硫酸鹽、亞硫酸鹽、二氧化硫、硫代硫酸鹽等等以及元素硫在中等的或高的溫度下通過厭氧轉(zhuǎn)換為硫化物而被除去是眾所周知的，例如，見EP-A-0451922，WO 92/17410，WO 93/24416和WO 98/02524。這些過程通常需要可以是氫、一氧化碳或有機(jī)分子如乙醇和脂肪酸的電子供體(或氫供體)。
近來發(fā)現(xiàn)(Balk等，Int.J Syst.Evol.Microbiol，(2002)，52，1361-1368)某些熱袍菌(Thermotoga)可單獨(dú)，在與Methanothermobacter或熱脫硫弧菌(Thermodesulfovibrio)共培養(yǎng)下，或在硫、硫氧化物或有機(jī)硫化合物如蒽醌-2，6-二磺酸酯存在下進(jìn)行厭氧降解甲醇。

發(fā)明內(nèi)容
依照本發(fā)明可以發(fā)現(xiàn)，Thermotogales目的厭氧嗜熱細(xì)菌，特別是來自棲熱袍菌屬(Thermotoga)的細(xì)菌，能夠在沒有氧氣時(shí)將甲烷轉(zhuǎn)化成氫或氫等價(jià)物。發(fā)現(xiàn)甲烷碳原子被轉(zhuǎn)化為二氧化碳而并未合并在生物質(zhì)中。產(chǎn)生的氫可以用作氫，或可以用來提供適合于還原不同化合物如含硫化合物(如硫酸鹽、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽)的氫等價(jià)物。而且還發(fā)現(xiàn)生物還原反應(yīng)所必需的氫等價(jià)物可以由通過厭氧性甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)行的甲烷氧化而有效地提供。因此，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生氫或氫等價(jià)物的方法，其是在厭氧條件下將甲烷處于一種或多種Thermotogales種的活性下。同樣地，本發(fā)明涉及一種使用Thermotogales種或菌株進(jìn)行厭氧氧化甲烷的方法。此外，本發(fā)明涉及一種用于生物還原化學(xué)品如硫化合物和金屬的方法，其中所需的氫等價(jià)物通過將甲烷處于厭氧甲烷氧化細(xì)菌中而產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及氫或氫等價(jià)物的厭氧細(xì)菌制備。在此上下文中，氫等價(jià)物被理解為包括降低基體氧化態(tài)的原子、分子或電子，即還原態(tài)等價(jià)物。這些包括例如醋酸鹽和甲酸鹽。它們也指電子供體。當(dāng)本方法產(chǎn)生不同于(分子)氫的氫等價(jià)物時(shí)，該方法在適宜的能夠接受氫等價(jià)物的基體存在下實(shí)施。所涉及的是甲烷，也可以考慮更高的烷和鏈烯烴，如乙烷、乙烯、丙烷等。
依照本發(fā)明所使用的細(xì)菌是厭氧甲烷氧化(烷-氧化)細(xì)菌。這些細(xì)菌包括陸地的和水生的(海生的)種，其可以從熱液源、油井以及有時(shí)從厭氧嗜熱的生物反應(yīng)器中獲得。它們可以在多種環(huán)境條件下生長，并且它們可以是嗜溫的和/或嗜熱的，這取決于天然污染源以及可能的適應(yīng)過程。適宜細(xì)菌的例子屬于與通常嗜熱的Thermotogales目。Wery等人(FEMS Microbiol.Biol.41，(2002)105-114)和Reysenbach等人(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，52，(2002)685-690)給出了對(duì)它的描述。WO 02/06503中描述了它們由有機(jī)源如糖制備氫的用途。Thermotogales包括Marinitoga、Geotoga、Petrotoga、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、棲熱腔菌屬(Thermosipho)和閃爍桿菌屬(Fervidobacterium)。它們特別選自包含后三類的組中。這些包括(帶有DSM登記號(hào))海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)(DSM 3109)、溫泉棲熱袍菌(Thermotoga thermarum)(DSM 5069)、Thermotogahypogea(DSM 11164)、Thermotoga subterranea(DSM 9912)、埃氏熱袍菌(Thermotoga elfei)(DSM 9442)、Thermotoga lettingae(DSM 14385)、Thermosipho melanesiensis(DSM 12029)、Thermosipho geolei(DSM13256)、海島閃爍桿菌(Fervidobacterium islandicum)(DSM 5733)和多節(jié)閃爍桿菌(F.nodosum)(DSM 5306)。它們中的大多數(shù)可以以被認(rèn)可的培養(yǎng)物收集如DSM或ATCC的方式得到，并且它們中的一些如海棲熱袍菌的基因組已經(jīng)被測序(Nelson等，Nature(1999)，399，323-329)。
如果需要并且優(yōu)選在適應(yīng)要求的工藝條件后，甲烷氧化的細(xì)菌可以用作上述種或菌株中的一種的純培養(yǎng)物或與其它細(xì)菌作為限定的混合物，或者作為從環(huán)境樣品或從生物反應(yīng)器中得到的混合培養(yǎng)物的一部分。純培養(yǎng)物的使用在允許過程按所希望的來控制方面占有優(yōu)勢。本發(fā)明也涉及這種純培養(yǎng)物以及下面所進(jìn)一步說明的限定的培養(yǎng)物的組合物。
用于本發(fā)明的方法中的種是嗜溫的或嗜熱的種。嗜熱的種在50℃和100℃之間具有它們最大的活性，但是如果需要在適應(yīng)之后，它們?cè)?0℃和50℃之間的溫度下乃至從25℃向上用于實(shí)施過程的中溫溫度范圍也通常是十分活潑的。嗜溫的種在30℃和50℃之間具有它們最大的活性，但是從20℃并且直到例如60℃也是十分活潑的。本發(fā)明方法的更優(yōu)選的溫度為25℃和90℃之間，最優(yōu)選在30℃和60℃之間。
在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，進(jìn)行厭氧甲烷氧化以制備分子氫。相關(guān)的總反應(yīng)可以簡化如下
培養(yǎng)基包含基本的添加生長要素的礦質(zhì)培養(yǎng)基，例如甲烷通過噴射或其他保證能與微生物密切接觸的方法引入。產(chǎn)生的氫可以被收集，例如，可以使用氣體再循環(huán)，其中氣體與選擇性膜相接觸，該選擇性膜對(duì)于氫來說是可滲透的而對(duì)于包括甲烷的大分子來說是不滲透的，剩余的氣體可以再循環(huán)到甲烷氧化反應(yīng)器中。或者，可以以這種方式安排適當(dāng)選擇的吸收劑使得從反應(yīng)器演變來的氣體與吸收劑相接觸。氫從反應(yīng)混合物中有效的排出保證了甲烷到氫的充分的生物轉(zhuǎn)化。產(chǎn)生的氫可以用作燃料或作為化學(xué)合成試劑或用于生物學(xué)或化學(xué)還原處理中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行厭氧性甲烷氧化以用于還原基體，例如硝酸鹽，偶氮化合物，無機(jī)和有機(jī)硫化合物如元素硫、硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、多硫化物、蒽醌-2，6-二磺酸鹽，溶解的金屬，氧化的鹵素化合物，硝酸鹽和其它必須被去除的化合物。如果適當(dāng)?shù)脑趶臍怏w流中通過洗氣或類似方法萃取以后，化合物可以存在于廢液流中。它們也可以作為例如土壤污染物而存在。被還原的化合物也可以存在于用于制備所希望的還原化合物的生產(chǎn)線中。下列反應(yīng)可以適用
其中A為氫受體，AH2可以被等價(jià)物或隨后的轉(zhuǎn)換產(chǎn)物所替換。依照這個(gè)實(shí)施方案，使用的甲烷氧化細(xì)菌包括那些如上所述的Thermotogales，以及其它甲烷氧化劑，例如那些與脫硫八疊球菌(Desulfosarcina)有關(guān)的。特別地，還原步驟本身是一種利用適宜的呼吸有機(jī)體而進(jìn)行的生物還原。

圖1中示意說明了這個(gè)過程。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用厭氧甲烷氧化以還原經(jīng)氧化的硫化合物，如硫酸鹽、亞硫酸鹽和元素硫。下文中，指的是硫酸鹽，但是也包括其它的硫-氧物種，如亞硫酸鹽和氫化的(例如亞硫酸氫鹽)以及中性的(例如三氧化硫)等價(jià)物。相關(guān)的總反應(yīng)可以簡化如下
這個(gè)實(shí)施方案要求能夠?qū)涞葍r(jià)物轉(zhuǎn)移到硫酸鹽的試劑的存在。這種試劑特別是本領(lǐng)域中所熟知的硫酸鹽還原微生物。適宜的硫酸鹽-還原微生物包括來自細(xì)菌的硫酸鹽還原屬的嗜溫的和嗜熱的氫-使用菌株，例如Desulforomonas、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、熱脫硫弧菌屬(Thermodesulfovibrio)和脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)(例如WO98/02524中描述的菌株)以及archaeal硫酸鹽-還原屬，例如古生球菌(Archaeoglobus)，如深處古生球菌(A.profundus)。
通過共培養(yǎng)包括如上所述的厭氧甲烷氧化劑進(jìn)行的硫酸鹽的轉(zhuǎn)化可以在常規(guī)的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，該反應(yīng)器具有一個(gè)用于包含硫酸鹽的水(例如源自氣體脫硫裝置的流體)的入口，一個(gè)用于甲烷供給的氣體入口，一個(gè)用于包含硫化物的水的液體出口，一個(gè)用于所得到的氣體混合物包含例如殘余的甲烷、氫、硫化氫的氣體出口以及任選用于負(fù)載生物質(zhì)并且使其保持與液體和(溶解的)氣態(tài)材料有效接觸的裝置，任選的用于將氣體產(chǎn)物從培養(yǎng)混合物中分離的過濾器以及用于保持所希望的反應(yīng)器溫度的裝置。此外，可以配備一個(gè)用于分離所得到的氣體混合物和返回回收的甲烷的氣體分離裝置以及一個(gè)用于處理硫化氫的處理裝置，例如一種用于將硫化物生物學(xué)轉(zhuǎn)化為元素硫并且用于分離硫的裝置。由于細(xì)菌不將甲烷用于它們的細(xì)胞合成，因此除甲烷之外，應(yīng)該提供給生物反應(yīng)器更多的碳源，例如甲醇、乙醇、有機(jī)酸、酵母抽提物或其組分、或者其它的有機(jī)物質(zhì)。
圖2-5示意說明了使用甲烷-氧化劑和硫酸鹽-還原劑的共培養(yǎng)物還原硫化合物的方法的方案。圖2為將硫酸鹽還原到硫化物，接著通過硫化物的生物氧化而成為元素硫的流程圖。圖3顯示了與金屬以利用產(chǎn)生的硫化氫而得到的金屬硫化物(MeS)的形式沉淀反應(yīng)共同發(fā)生的硫酸鹽還原反應(yīng)以及過剩的硫化氫變?yōu)樵亓虻难趸磻?yīng)。圖4顯示了通過分離汽提或者通過使用甲烷流進(jìn)行硫化氫去除的制備硫化氫方法的二種變體。硫化氫可以被濃縮并用于硫酸的生產(chǎn)。圖5圖解說明了二氧化硫通過洗滌(第一階段)隨后通過如圖2所示的生物還原從氣體中的去除。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用于將有毒的溴酸鹽或氯酸鹽還原到較低毒性的溴化物和氯化物。這些化合物可以存在于化學(xué)工業(yè)的工業(yè)用水中。溴酸鹽或氯酸鹽的還原要求可以是硫酸鹽-還原細(xì)菌和古細(xì)菌的溴酸鹽-或氯酸鹽-還原種的存在。能夠還原氯酸鹽或溴酸鹽的種包括那些屬脫氯體細(xì)胞(Dechlorosoma)、Dechloromonas和假單胞菌屬(Pseudomonas)如Pseudomonas chloritidismutans，Dechloromonas agitata，Dechlorosoma suillum，菌株GR-1。同樣地，使用通常所周知的脫氮菌可以進(jìn)行硝酸鹽的還原。已知的脫氮菌包括施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，脫氮附球菌(Paracoccusdenitrificans)，死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus-aureus)。
依照另外的實(shí)施方案，該方法可以被用于將金屬離子還原到它們的低價(jià)或零價(jià)態(tài)。它們可以在這些低價(jià)態(tài)例如作為氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽、硫化物或中性金屬被沉淀并分離。例如在WO00/39035中描述了金屬的生物還原。能夠被還原并轉(zhuǎn)化成不溶的金屬或不溶的金屬氧化物、氫氧化物或類似物的金屬的例子包括硒、碲、鈾、鉬、釩、鉻和錳。能夠還原這些金屬的細(xì)菌包括屬Geobacter，假單胞菌屬(Pseudomonas)，西瓦氏菌屬(Shewanella)、脫硫弧菌屬(De-sulfovibrio)、脫硫細(xì)菌屬(Desulfobacterium)、脫硫鹽菌屬(Desulfomicrobium)、脫硫單胞菌屬(Desulforomonas)和異單胞菌屬(Alteromonas)。如果需要，可以使用如WO 00/39035中所描述的移動(dòng)的砂濾器用于分離所得到的金屬沉淀物。
(生物)還原過程中甲烷-氧化細(xì)菌在提供還原等價(jià)物上的使用從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)方面來說是有利的。目前的使用甲烷作為最終還原劑的方法要求中間使用由甲烷通過化學(xué)(催化)重整產(chǎn)生的氫。這意味著對(duì)重整爐或類似裝置的投資和使用并且也消耗約50％的甲烷用于通過必要的燃燒以保持催化過程處在必要的高溫下。本生物學(xué)方法消除了這些缺點(diǎn)，因而導(dǎo)致了既在設(shè)備成本又在生產(chǎn)成本方面真正的成本節(jié)約(例如，低50％的甲烷消耗量)。
本發(fā)明的方法可以在厭氧型的常規(guī)生物反應(yīng)器中進(jìn)行，該反應(yīng)器帶有用于將氣體引入反應(yīng)器內(nèi)的裝置以及從反應(yīng)器的頂部空間帶走氣體的裝置。反應(yīng)器可以是攪拌型的，但優(yōu)選的反應(yīng)器為帶有存在于載體微粒如沙子、玄武巖，聚合物顆粒等上的或以顆粒、板材、膜等等形式存在的生物膜型反應(yīng)器，以便優(yōu)化基體(甲烷)和微生物之間的接觸，(如果是共培養(yǎng)物，則是不同的微生物之間的接觸)。
一個(gè)適宜的用于生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)器類型的例子是所謂的氣開-環(huán)反應(yīng)器(gaslift-loop reactor)。這是一類當(dāng)必須將氣體基體供應(yīng)給反應(yīng)時(shí)特別有利的反應(yīng)器。它使用被在反應(yīng)器的底部引入的氣體(甲烷)活化的垂直環(huán)流進(jìn)行操作。這種反應(yīng)器的一個(gè)例子是在荷蘭的BudelZinc的鋅車間使用的500m3氣開-環(huán)反應(yīng)器。在此情況下，10噸/天的硫酸鹽通過加入12,000nm3/天的氫氣被生物還原。此外，部分生物反應(yīng)器廢氣通過壓縮機(jī)回收以提高氫氣使用的效率。這里20000nm3/天的天然氣在蒸汽轉(zhuǎn)化裝置中被轉(zhuǎn)化以提供必要量的氫氣。當(dāng)使用如上所述的厭氧甲烷氧化時(shí)，可以忽略重整爐并且可以直接將甲烷引入反應(yīng)器。
另一種適宜的反應(yīng)器類型是膜生物反應(yīng)器，其中通過將反應(yīng)器流出物穿過(膜)過濾器而實(shí)現(xiàn)生物體保留。膜生物反應(yīng)器也可用于分離氣體產(chǎn)物(如氫或硫化氫)。在這樣一類的實(shí)施方案中，可滲透氣體(例如硫化氫)的膜將反應(yīng)器液體從反應(yīng)器的氣體空間分離，吸附性氣體穿過膜以帶走氣體。這樣允許了反應(yīng)器保持低的硫化氫水平而無需高水位流經(jīng)反應(yīng)器。
本發(fā)明的方法可以在大氣壓下進(jìn)行，或者如果希望可使用適當(dāng)?shù)哪蛪貉b置在高壓如10-100巴的壓力下進(jìn)行。高壓可有利于增加使用甲烷的生物學(xué)方法的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例菌株 海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)(DSM 3109)和深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)(DSM5631)從Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen(Braunschweig，DE)購得。在我們的實(shí)驗(yàn)室分離出T lettingae(DSM 14385)和脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)菌株WW1。
培養(yǎng)工藝 在本研究中自始至終使用厭氧培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞在典型地用0.15g/l的酵母抽提物補(bǔ)充的厭氧培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)基包含(每升軟化水)0.335gKCl，4.0gMgCl2·6H2O，3.45gMgSO4·7H2O，0.25gNH4Cl，10gNaCl，0.10gK2HPO4，4.0gNaHCO3，0.5gNa2S·9H2O，1.0gNa2SO4，0.73gCaCl2·2H2O，10ml微量元素以及5ml以DSM的培養(yǎng)基141(http//www.dsmz.de)為基準(zhǔn)的二次濃縮的維生素溶液。將培養(yǎng)基煮沸并在厭氧的N2氣流下冷卻至室溫。將培養(yǎng)基厭氧分配到血清瓶中并施加180kPa的氣相N2/CO2(80/20，v/v)。將瓶用丁基橡膠膠塞封閉并用鋸齒形焊縫密封。將培養(yǎng)基在121℃下熱壓處理20min。在氮?dú)鈿夥障轮苽銷aHCO3、Na2S、CaCl2和維生素溶液的原液并在消毒之后加入。維生素溶液包含更高量維生素B12和維生素B1，導(dǎo)致培養(yǎng)基的濃度分別為0.5和0.1mg·l-1。從1M過濾消毒的原液中加入硫代硫酸鹽。在熱壓處理之前將計(jì)算量的13C-甲烷注入到瓶中。對(duì)于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將深處古生球菌(A.profundus)和脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)種菌株WW1在248ml血清瓶中，H2和CO2環(huán)境下和50ml培養(yǎng)基分別在80℃和65℃生長。作為補(bǔ)充的碳源，加入1mM的醋酸鈉。將硫酸鹽還原劑生長1天然后將氣相變?yōu)?80kPa的N2/CO2(80/20，v/v)，并且將CH4氣體加到最終濃度為1.75mmol/瓶。將深處古生球菌(A.profundus)培養(yǎng)物用海棲熱袍菌(T.maritima)接種，脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)種用T.lettingae接種。對(duì)于接種，使用海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae的甲烷適應(yīng)培養(yǎng)物。由于培養(yǎng)基已經(jīng)包含大約1mmol硫酸鹽/瓶，因此沒有加入硫酸鹽。
分析方法 高純的(最低99％13C)甲烷氣體由Campro ScientificB.V.(Veenendaal，NL)獲得。制備含有50ml培養(yǎng)基中大約1.75mmol作為基體的13C甲烷的血清瓶。制備帶有或不帶有13C甲烷、硫代硫酸鹽和生物體的控制瓶。NMR-管包含樣品、10％(v/v)D2O和100mM二氧六環(huán)以給出15ml的最終容量。利用Bruker AMX-300 NMR光譜計(jì)在75.47MHz下記錄樣品的氘核-去偶的13C核磁共振光譜。對(duì)于每個(gè)光譜，使用32k數(shù)據(jù)點(diǎn)、45°脈沖角以及脈沖之間1s的延遲時(shí)間累加7200瞬態(tài)(5h)并存在磁盤上。測量溫度保持在10℃，并且將屬于二氧六環(huán)碳原子核的化學(xué)位移(67.4ppm)用作內(nèi)標(biāo)。樣品中的氘(10％，v/v)用來做場自動(dòng)跟蹤，二氧六環(huán)作為內(nèi)標(biāo)。
在室溫下氫和甲烷由氣相色譜(GC)(參見Stams等，Appl.Environ.Microbiol.(1993)59 114-1119)或裝備有質(zhì)量選擇探測器(MS)的GC(Hewlett Packard型5890)測定。在毛細(xì)管柱(innowax，30m×0.25mm(dF＝0.5μm)，Packard，NL)上使用氦氣作為載氣分離甲烷、二氧化碳和它們的穩(wěn)定同位素。采用分流注射器(入口壓力1kPa；分流比25∶1)在柱溫35℃下注入氣體樣品(200μl)。分別在m/z為16和17以及44和45處監(jiān)控甲烷和二氧化碳以及它們的穩(wěn)定同位素?？偟募淄楹虲O2濃度由氣相色譜定量測定(參見Stams等，(1993上述))。由酸化后在氣相中積累的CO2的量計(jì)算H13CO3-在液相中的濃度。通過HPLC分析硫代硫酸鹽和硫酸鹽(參見Scholten and Stams，Antonie vanLeeuwenhoek(1995)68，309-315)。硫化物按Trüper和Schlegel所描述的方法測定(參見Antonie van Leeuwenhoek(1964)30，225-238)。
實(shí)施例1.由熱袍菌(Thermotoga)進(jìn)行的無氧甲烷氧化采用高純的13C示蹤的甲烷在嚴(yán)格的厭氧條件以及作為電子受體的硫代硫酸鹽存在下培養(yǎng)海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)和T.lettingae。進(jìn)行試驗(yàn)并且分別研究培養(yǎng)溫度為80℃和65℃的完全相同的培養(yǎng)物。通過利用氣相色譜(GC)和GC-質(zhì)譜(MS)分析氣相以及通過使用用于液體樣品的核磁共振光譜(NMR)測定甲烷氧化和產(chǎn)物形成。
在酸化的樣品中，通過使用GC測量了培養(yǎng)40天后積累在氣相中的總的CO2量(表1)。在沒有甲烷的包含總共4.87mmol二氧化碳/瓶的控制培養(yǎng)物中，可以觀察到輕微的生長，這歸結(jié)于酵母抽提物在培養(yǎng)基中的存在，從而，可以發(fā)現(xiàn)未做標(biāo)記的CO2。在13C甲烷和硫代硫酸鹽存在下由海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae引起的生長導(dǎo)致了細(xì)胞數(shù)目顯著增加(表1)。在40天培養(yǎng)后，采用兩個(gè)培養(yǎng)物的甲烷的化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了幾乎相等量的產(chǎn)物。對(duì)于T.lettingae來說，13C在CO2中的百分比液相中為5.9％，氣相中為2.1％。這些值對(duì)于海棲熱袍菌(T.maritima)來說分別為6.2％和2.4％。在兩個(gè)樣品中，甲烷氧化成二氧化碳與硫代硫酸鹽還原成硫化物的比分別約為1∶1和1∶2。幾乎1mmol的13C甲烷/瓶被兩種細(xì)菌利用。瓶中剩余的甲烷沒有被利用，甚至在40天的長時(shí)間培養(yǎng)之后。但是，當(dāng)加入少量的甲烷(相當(dāng)于0.5mmol/瓶)后，所有的13C甲烷完全被兩種細(xì)菌利用。在這兩種情況下，大約10天之后開始可測量的甲烷轉(zhuǎn)化。由海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae引起的厭氧甲烷轉(zhuǎn)化的速率分別為32和30mol/瓶·天。對(duì)于海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae來說所計(jì)算的13C碳回收分別為82％和79％。
表1a.硫代硫酸鹽存在下由T.maritima引起的13C甲烷氧化

表1b.硫代硫酸鹽存在下由T.lettingae引起的13C甲烷氧化

；值按mmol/瓶計(jì)算并用控制樣品校正。所有測量重復(fù)進(jìn)行兩次，并且計(jì)算每個(gè)樣品的最高值*；總的CO2包括來自培養(yǎng)基組成的液相和氣相中的CO2以及形成的13C-CO2#；總的硫化物包括來自培養(yǎng)基組成的液相和氣相中的硫化物以及在甲烷氧化過程中形成的硫化物；在計(jì)數(shù)細(xì)胞過程中沒有考慮氣球樣細(xì)胞實(shí)施例2生物質(zhì)分析將Thermotoga lettingae和海棲熱袍菌(T.maritima)與示蹤的甲烷和硫代硫酸鹽分別在65和80℃生長。在生長之后，離心分離細(xì)胞。分析13C在上層清液和細(xì)胞球中的百分比。正如以前所示，形成13C示蹤的重碳酸鹽，但是我們不能檢測出任何合并進(jìn)入生物質(zhì)的標(biāo)記。這表明，細(xì)胞生物質(zhì)沒有由甲烷或它的降解產(chǎn)物形成，而是由提供給培養(yǎng)基的酵母抽提物形成。因而，看起來細(xì)菌具有分裂新陳代謝。
酶活性在由甲烷生長的細(xì)胞制備的無細(xì)胞抽提液中測定甲烷氧化活性。我們能夠測量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)-從屬的甲烷脫氫酶在pH為9和65℃下的高活性(＞1mol.min-1.mg-1蛋白質(zhì))。在80℃不能測出活性。表觀反應(yīng)為
這個(gè)反應(yīng)的吉布斯自由能變化大約為+90kJ/mol。因此，這個(gè)反應(yīng)只能在基體的濃度高而產(chǎn)物的濃度低時(shí)發(fā)生。我們能夠證明，化驗(yàn)混合物中甲醇的加入抑制了反應(yīng)，并且當(dāng)NAD+濃度增加時(shí)，可以測出高的活性。
實(shí)施例3 由與熱袍菌(Thermotoga)的共培養(yǎng)物引起的硫酸鹽還原通過將深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)與海棲熱袍菌(T.maritima)在80℃下以及將脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)菌株WW1與T.lettingae在65℃下生長而進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(表2)。在這兩種情況下，硫酸鹽作為電子受體使用。對(duì)于這兩種共培養(yǎng)物來說，CO2從甲烷的形成與硫酸鹽轉(zhuǎn)化成硫化物的比接近1∶1。計(jì)算的甲烷轉(zhuǎn)化速率低于在硫代硫酸鹽的約為20mol/瓶·天的情況。甲烷的轉(zhuǎn)化連同硫酸鹽還原導(dǎo)致了熱袍菌(Thermotoga)和硫酸鹽還原微生物的多于十倍增長的細(xì)胞數(shù)目。對(duì)于海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae的共培養(yǎng)物來說，計(jì)算的13C碳回收分別為85％和78％。
表2a.硫酸鹽存在下由T.maritime(T.m.)與Archaeoglobusprofundus(A.p.)的共培養(yǎng)物引起的13C甲烷氧化

表2b.硫酸鹽存在下由T.lettingae(T.l.)與Desulfotomaculum種菌株WW1(WW1)的共培養(yǎng)物引起的13C甲烷氧化

符號(hào)見表1。
先前的結(jié)果表明，海棲熱袍菌(T.maritima)和T.lettingae能夠在其他的C1化合物如H2-CO2、甲酸鹽、甲醇以及甲胺在硫代硫酸鹽和酵母抽提物18存在下生長。我們也觀察到，0.5～5.0g/l酵母抽提物的加入導(dǎo)致了更好的生長，從而甲烷氧化也稍微快于在原始培養(yǎng)基中的甲烷氧化。在沒有酵母抽提物的情況下，純培養(yǎng)物不能生長，即使不在葡萄糖上。當(dāng)培養(yǎng)基中加入2.5g/l的酵母抽提物時(shí)，甲烷的利用率對(duì)于海棲熱袍菌(T.maritima)來說可以從32增加到33μmol/瓶·天，對(duì)于T.lettingae來說可以從30增加到31μmol/瓶。然而，與原始培養(yǎng)基內(nèi)包含0.15g/l酵母抽提物的研究結(jié)果相似，甲烷氧化只在培養(yǎng)大約10天之后才開始。當(dāng)加入超過5.0g/l的酵母抽提物時(shí)，兩種生物體的生長更好，但是甲烷氧化速率沒有高于得到的值。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種用于轉(zhuǎn)化甲烷以產(chǎn)生氫或氫等價(jià)物的方法，其特征在于將甲烷厭氧處于Thermotogales目的甲烷氧化細(xì)菌的活性下。
2.權(quán)利要求1的方法，其中甲烷氧化細(xì)菌包括熱袍菌(Thermotoga)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中熱袍菌包括海棲熱袍菌或T.lettingae。
4.權(quán)利要求1～3之一的方法，其在25-90℃的溫度下實(shí)施。
5.權(quán)利要求1～4之一的方法，其在硫代硫酸鹽存在下實(shí)施。
6.一種使用氫等價(jià)物通過生物還原來還原化合物的方法，其特征在于氫等價(jià)物通過將甲烷處于Thermotogales目的厭氧性甲烷氧化細(xì)菌下制備。
7.權(quán)利要求6的方法，其中使用硫酸鹽還原種將含硫化合物還原成硫化物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中含硫化合物包括硫酸鹽和/或亞硫酸鹽。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中厭氧性甲烷氧化種包括熱袍菌(Thermotoga)、棲熱腔菌(Thermosipho)或閃爍桿菌(Fervidobacterium)。
10.權(quán)利要求7或8的方法，其中硫酸鹽還原種包括古生球菌(Archaeglobus)、脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)、Desulforomonas、脫硫弧菌(Desulfovibrio)或熱脫硫弧菌(Thermodesulfovibrio)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中金屬從高價(jià)態(tài)被還原到低價(jià)態(tài)或零價(jià)態(tài)。
12.權(quán)利要求6～11之一的方法，其中使用25-90℃的溫度。
13.一種混合的培養(yǎng)物，其包含一種或多種厭氧性甲烷氧化Thermotogales種，以及一種或多種硫酸鹽還原或金屬還原古生球菌(Archaeglobus)、脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)、Desulforomonas或脫硫弧菌(Desulfovibrio)。
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)化甲烷以產(chǎn)生氫或氫等價(jià)物的方法，其特征在于將甲烷厭氧處于Thermotogales目的甲烷氧化細(xì)菌的活性下。
2.權(quán)利要求1的方法，其中甲烷氧化細(xì)菌包括熱袍菌(Thermotoga)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中熱袍菌包括海棲熱袍菌或T.lettingae。
4.權(quán)利要求1～3之一的方法，其在25-90℃的溫度下實(shí)施。
5.權(quán)利要求1～4之一的方法，其在硫代硫酸鹽存在下實(shí)施。
6.一種使用氫等價(jià)物通過生物還原來還原化合物的方法，其特征在于氫等價(jià)物通過將甲烷處于Thermotogales目的厭氧性甲烷氧化細(xì)菌下制備。
7.權(quán)利要求6的方法，其中使用硫酸鹽還原種將含硫化合物還原成硫化物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中含硫化合物包括硫酸鹽和/或亞硫酸鹽。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中厭氧性甲烷氧化種包括熱袍菌(Thermotoga)、棲熱腔菌(Thermosipho)或閃爍桿菌(Fervidobacterium)。
10.權(quán)利要求7或8的方法，其中硫酸鹽還原種包括古生球菌(Archaeglobus)、脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)、Desulforomonas、脫硫弧菌(Desulfovibrio)或熱脫硫弧菌(Thermodesulfovibrio)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中金屬從高價(jià)態(tài)被還原到低價(jià)態(tài)或零價(jià)態(tài)。
12.權(quán)利要求6～11之一的方法，其中使用25-90℃的溫度。
13.一種混合的培養(yǎng)物使用，包含一種或多種厭氧性甲烷氧化Thermotogales種，以及一種或多種硫酸鹽還原或金屬還原種，特別是古生球菌(Archaeglobus)、脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum)、Desulforomonas或脫硫弧菌(Desulfovibrio)。
全文摘要
甲烷可以在使用Thermotogales目的嗜溫的或嗜熱的細(xì)菌例如海棲熱袍菌的生物學(xué)方法中，用作產(chǎn)生氫或氫等價(jià)物的源。氫可以按照這種方法制備，或者作為還原等價(jià)物用于還原各種化合物如硫化合物。特別地，甲烷氧化可用于在硫酸鹽還原微生物的共培養(yǎng)物種使用甲烷作為主要的或單一的電子給體，將硫酸鹽厭氧還原到硫化物。
文檔編號(hào)C12P3/00GK1714154SQ200380103825
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者阿爾方斯·約翰尼斯·瑪麗亞·施塔姆斯, 塞斯·揚(yáng)·尼科·比伊斯曼, 亨德里克·戴克曼, 威廉·邁因德特·德福斯 申請(qǐng)人:帕克斯公司