專(zhuān)利名稱(chēng)：一種限制性熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記方法，特別是涉及一種限制性熒光標(biāo)記方法，可用于同時(shí)擴(kuò)增并標(biāo)記樣品中的多種靶基因。
常用的標(biāo)記方法包括反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法、隨機(jī)引物延伸法、PCR擴(kuò)增法等。在表達(dá)譜芯片的檢測(cè)中常采用反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記或隨機(jī)引物延伸法進(jìn)行標(biāo)記，以反映各種基因表達(dá)豐度的差異；而病原體的檢測(cè)中為提高檢測(cè)的靈敏度常采用PCR標(biāo)記的方法。在標(biāo)記反應(yīng)中加入Cy3、Cy5標(biāo)記的dUTP或dCTP，這些熒光標(biāo)記物在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被隨機(jī)摻入到新合成的DNA分子中。上述這些方法存在如下局限性①所述的熒光核苷酸非任何聚合酶的天然底物，與核苷酸相連的熒光部分通常比較大，所以聚合酶摻入核苷酸的效率會(huì)比摻入其天然底物的效率低得多，因此可能會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄及PCR產(chǎn)物的形成。②所述的熒光核苷酸是以一種隨機(jī)的方式被摻入到新鏈中，因此，樣品中各種核酸的熒光摻入量存在一定的差異，以這種方法比較基因的表達(dá)量時(shí)就會(huì)出現(xiàn)偏差。③所述的熒光核苷酸類(lèi)似物相當(dāng)昂貴，在反轉(zhuǎn)錄或PCR中需要量較大。因此，需要采用替代的標(biāo)記方法，以增加終產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，同時(shí)降低成本。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所述的限制性熒光標(biāo)記方法依次包括以下步驟(1)以限制性核酸內(nèi)切酶消化由樣品核酸提取純化后反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA或者以多對(duì)針對(duì)多種靶基因而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生許多大小較為一致的限制性基因片段；(2)設(shè)計(jì)接頭，與上述限制性酶切片段連接；(3)根據(jù)上述限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)PCR通用引物，并在上述引物的5′端標(biāo)記上熒光分子；(4)以熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增樣品，該擴(kuò)增樣品經(jīng)純化后與DNA芯片雜交。
上述步驟的流程示意圖如

圖1所示，圖中的U代表通用引物。
所述的步驟(3)中，在PCR通用引物的5′端標(biāo)記上的熒光分子可以是Cy3、Cy5或生物素等。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)①由于熒光分子不是標(biāo)記在核苷酸上，所以不會(huì)影響聚合酶摻入核苷酸的效率以及反轉(zhuǎn)錄、PCR產(chǎn)物的形成，大大提高熒光分子的摻入率，可高達(dá)100％，因此雜交信號(hào)顯著增強(qiáng)。②通過(guò)采用限制性酶切后擴(kuò)增的方法，將樣品核酸的靶基因酶切成許多個(gè)大小約為250bp的片段并都標(biāo)記上等量的熒光，多段靶基因均可與芯片的探針雜交，擴(kuò)大了雜交的范圍，提高了檢測(cè)的效率。③由于采用PCR擴(kuò)增的方法，且熒光分子的摻入率高，所以熒光物的用量可顯著減少。④每個(gè)新合成的DNA分子都帶有同等量的熒光分子，便于比較樣品中多種基因的表達(dá)量。標(biāo)記過(guò)程中可根據(jù)模板量來(lái)調(diào)節(jié)PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)而有效地應(yīng)用于基因表達(dá)譜芯片的基因差異表達(dá)分析。⑤以一個(gè)引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的多種靶基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，尤其適用于多種病原體混合感染時(shí)基因的檢測(cè)。⑥本發(fā)明所述的標(biāo)記方法適合各種類(lèi)型的芯片，如寡核苷酸芯片、cDNA芯片等，尤其適合以限制性擴(kuò)增方法制備的cDNA探針或基因探針來(lái)制作的芯片，因?yàn)橐韵拗菩訮CR標(biāo)記片段的大小與探針較一致，有利于這兩者之間的雜交，使雜交信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，提高檢測(cè)效率。而在隨機(jī)引物延伸的標(biāo)記反應(yīng)中，由于隨機(jī)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，所以標(biāo)記的片段與探針大小的匹配程度低，雜交的信號(hào)相對(duì)較弱。因此，以一套引物進(jìn)行限制性擴(kuò)增方法制備探針，以另一套引物進(jìn)行限制性PCR標(biāo)記樣品，這種芯片的設(shè)計(jì)可使芯片的制作與雜交的過(guò)程得到優(yōu)化。
綜上所述，本發(fā)明采用熒光分子標(biāo)記的通用引物進(jìn)行限制性PCR標(biāo)記待測(cè)樣品，可大大提高芯片檢測(cè)的靈敏度，尤其適合臨床病原體基因的檢測(cè)芯片。
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖2是本發(fā)明的實(shí)施例中的雜交圖譜。
本實(shí)施例的限制性熒光標(biāo)記方法依次包括如下步驟(1)以限制性?xún)?nèi)切酶Sau3A I酶切HIV1U26942 DNA樣品，產(chǎn)生具有“GATC”粘性末端的限制性片段。酶切反應(yīng)可參考以下方法取約1μg HIV1U26942 DNA，加入2μl10×內(nèi)切酶緩沖液，1μl Sau3A I，加雙蒸水(ddH2O)至20μl，37℃反應(yīng)1～2小時(shí)。
(2)設(shè)計(jì)接頭，與上述限制性酶切片段連接以O(shè)ligo 6.0軟件設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸鏈S1P(5′-pGATCmCAC ACCAGC CAA ACC CA-3′)與S1R(5′-GGTTTGGCTGGTGTG-3′)，合成后溶于雙蒸水中。在微量管中將兩者等量(等摩爾數(shù))混合，加熱至90℃，5分鐘。然后，置于PCR儀上，90℃3分鐘36秒，80℃3分鐘36秒，70℃3分鐘36秒，60℃3分鐘36秒，50℃3分鐘36秒，40℃3分鐘36秒，30℃3分鐘36秒，20℃3分鐘36秒，4℃保持，形成的接頭(S1P/S1R)如下GATCCACACCAGCCAA ACCCA|||||||||||||||GTGTGGTCGGTTTGG以T4 DNA連接酶將上述限制性片段與接頭連接。連接反應(yīng)可參考以下方法在微量管中加入22μl去離子水，10×連接酶緩沖液3μl，形成的接頭2μl，酶切產(chǎn)物2μl，T4 DNA連接酶1μl，16℃反應(yīng)2～3小時(shí)，作為PCR反應(yīng)的模板。
(3)根據(jù)上述限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)PCR通用引物，并在上述引物的5′端標(biāo)記上熒光分子引物的設(shè)計(jì)引物U GTTTGGCTGGTGTGGATCGGTTTGGCTGGTGTG——GATCCACACCAGCCAA ACCCA||||||||||||||||||||||||||||||ACCCAAACCGACCACACCTAG——GTGTGGTCGGTTTGGCATGGTGTGGTCGGTTTG 引物U其中，橫線代表限制性酶切片段；兩端部分為接頭；其上方和下方的序列為設(shè)計(jì)的通用引物U5′-GTT TGG CTG GTG TGG ATC-3′。并在通用引物的5′端加上熒光分子Cy3，即Cy3-U5′Cy3-GTT TGG CTG GTG TGG ATC-3′。
(4)以熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增樣品為了便于比較，本實(shí)施例采用A和B兩個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行試驗(yàn)，其中，B為本實(shí)施例的試驗(yàn)，A為對(duì)比試驗(yàn)。
在A、B兩個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入10μl 10×PCR緩沖液(500mmol/LKCl，100mmol/L Tris-HCl pH8.3，15mmol/L MgCl2)，10μl dNTPs(各2mmol/L)，1μl PCR反應(yīng)的模板。然后在A管中加入5μl Cy3-dCTP(1mmol/L)，2μl通用引物U(100μmol/L)；在B管中加入2μl Cy3-U(100μmol/L)。再加H2O至99μl。最后分別加入1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，輕輕混勻。于PCR儀(Perkin-Elmer 2400)上，95℃變性2分鐘后進(jìn)入30循環(huán)的PCR擴(kuò)增(95℃30秒鐘，68℃30秒鐘，72℃1分鐘)，72℃延伸5分鐘，使熒光分子被摻入擴(kuò)增的DNA片段中。采用QIAquick離心柱(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，并離心干燥。將干燥的產(chǎn)物溶于50μl ddH2O，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 取上述A和B的終產(chǎn)物等量與上述制備好的芯片進(jìn)行雜交。雜交后清洗玻片并干燥，掃描芯片并分析雜交結(jié)果，其雜交圖譜如圖2所示，其中，A區(qū)為對(duì)比試驗(yàn)的雜交圖譜，B區(qū)為本實(shí)施例的雜交圖譜，由圖中可知，本實(shí)施例以Cy3-U進(jìn)行限制性PCR反應(yīng)的雜交信號(hào)顯著高于對(duì)比試驗(yàn)中以Cy3-dCTP標(biāo)記的反應(yīng)(P＜0.001)。
權(quán)利要求
1.一種限制性熒光標(biāo)記方法，依次包括以下步驟(1)以限制性核酸內(nèi)切酶消化由樣品核酸提取純化后反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA或者以多對(duì)針對(duì)多種靶基因而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生許多大小較為一致的限制性基因片段；(2)設(shè)計(jì)接頭，與上述限制性酶切片段連接；(3)根據(jù)上述限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)PCR通用引物，并在上述引物的5′端標(biāo)記上熒光分子；(4)以熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增樣品，該擴(kuò)增樣品經(jīng)純化后與DNA芯片雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性熒光標(biāo)記方法，其特征是所述的步驟(3)中，在PCR通用引物的5′端標(biāo)記上的熒光分子是Cy3、Cy5或生物素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種限制性熒光標(biāo)記方法，該方法依次包括以下步驟(1)以限制性核酸內(nèi)切酶消化由樣品核酸提取純化后反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA或者以多對(duì)針對(duì)多種靶基因而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生許多大小較為一致的限制性基因片段；(2)設(shè)計(jì)接頭，與上述限制性酶切片段連接；(3)根據(jù)上述限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)PCR通用引物，并在上述引物的5′端標(biāo)記上熒光分子；(4)以熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增樣品，該擴(kuò)增樣品經(jīng)純化后與DNA芯片雜交。本發(fā)明可顯著增強(qiáng)雜交信號(hào)，并同時(shí)顯著減少熒光物用量，大大提高芯片檢測(cè)的靈敏度，尤其適合臨床病原體基因的檢測(cè)芯片。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1473940SQ02134540
公開(kāi)日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者馬文麗, 鄭文嶺, 李凌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍基因工程研究所