專利名稱：編碼番茄乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/ap2dna結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域為生物技術(shù)領(lǐng)域。進一步，本發(fā)明涉及一種編碼番茄乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/AP2 DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子的基因及其應(yīng)用。
干旱、鹽漬和低溫是作物生長常遇到的惡劣環(huán)境條件，嚴重影響作物的產(chǎn)量和種植面積。我國的干旱和半干旱耕地共為5.7億畝，占全國耕地面積的38％，主要分布在擔負全國糧食生產(chǎn)主要任務(wù)的華北、東北和西北地區(qū)，這些地區(qū)因缺水造成每年糧食減產(chǎn)700-800億公斤。低溫冷害是我國南、北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長年發(fā)生的災(zāi)害，嚴重限制著早春作物的種植和晚秋作物的收獲。我國有5.54億畝的鹽漬土壤有待開墾利用或提高單產(chǎn)。其中1億畝為農(nóng)田，占我國耕地面積的7％左右。據(jù)估計，我國每年因鹽堿地而少產(chǎn)糧食約200億公斤。
由于干旱、鹽堿和低溫對植物生長發(fā)育的影響已成為我國以及世界農(nóng)業(yè)所面臨的嚴重問題，因而，培育抗逆作物新品種已成為當今農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個研究重點。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗逆基因?qū)胱魑镏惺翘岣咦魑锟剐杂N的一種非常有效的策略。干旱、鹽堿和低溫等非生物逆境引起植物細胞基因表達發(fā)生一系列變化。研究表明，逆境下大量基因被誘導表達。這些基因的表達產(chǎn)物可分為兩類一類為功能蛋白，它們直接參與植物細胞的抗逆反應(yīng)，包括各類滲透調(diào)節(jié)分子生物合成所需的酶類、LEA蛋白、抗凍蛋白、侶伴分子和抗氧化酶類等；另一類為調(diào)控蛋白，它們參與植物對逆境信號應(yīng)答反應(yīng)過程中的基因表達調(diào)節(jié)和信號傳導，包括信號系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、轉(zhuǎn)運蛋白以及與磷酸肌醇代謝有關(guān)的酶。現(xiàn)代研究表明，植物對非生物脅迫因素的反應(yīng)是由多基因控制的，單獨導入或改良個別功能基因?qū)ψ魑锟鼓嫘缘奶岣咦饔貌幻黠@，而將多個抗逆基因?qū)胫参锬壳叭杂幸欢ǖ募夹g(shù)困難(Tepperman等，1990，Plant Mol.Biol.14501-511；Pitcher等，1991，Plant Physiol，97452-455)。如何同時調(diào)控多種逆境脅迫反應(yīng)基因的表達，提高植物對逆境脅迫的適應(yīng)能力就是本發(fā)明希望解決的重要問題。
低溫(冷害)、干旱和鹽堿是限制作物產(chǎn)量的三大非生物脅迫因素，在生理上均可導致細胞水分虧缺，造成滲透脅迫(或稱水分脅迫)。細胞對失水做出響應(yīng)，首先要識別失水，然后啟動信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)并誘導基因表達。在這種信號轉(zhuǎn)導過程中，反式作用因子(也稱轉(zhuǎn)錄因子)具有重要的調(diào)控制作用，它能通過與逆境反應(yīng)基因啟動子中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用而啟動多個具有相同或類似順式作用元件基因的激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄(Riechmann和Meverowitx，1998，Biol Chem，379633-646)。因此，如果將編碼重要轉(zhuǎn)錄因子的基因?qū)胫参铮ㄟ^其產(chǎn)物實現(xiàn)對多個功能基因的調(diào)控，從而改進植物對逆境脅迫的綜合適應(yīng)能力，將具有事半功倍的作用。
在植物的正常生長情況下，編碼失水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(DREB1A)和C重復序列結(jié)合因子(CBF1)的cDNA的超表達激活了許多脅迫反應(yīng)基因的表達，并提高了植物的抗旱性、抗低溫性和抗鹽性(Jaglo-Ottosen等，1998，Science，280104-106；Liu等，1998，Plant Cell，101391-1406；劉強等，2000，科學通報，4511-16)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這類轉(zhuǎn)錄因子均含有植物特有的DNA結(jié)合域，即乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白(EREBP)/AP2(APETALA2)DNA結(jié)合域。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，這些蛋白可分為兩類，即EREBP和AP2，它們分別存在于單子葉和雙子葉植物中，并與細胞發(fā)育及植物對激素、病原菌和逆境的分子應(yīng)答有關(guān)(Zhou等，1997，EMBO J，163207-3218；Liu等，Plant Cell，1998，101391-1406；Jaglo-Ottosen等，1998，Science，280104-106；Fujimoto等，2000，Plant Cell，12393-404)。AP2類蛋白具有2個AP2域，它們參與植物的發(fā)育過程；EREBP類蛋白僅含有單個AP2域，它們參與植物適應(yīng)生物和非生物逆境脅迫過程。根據(jù)EREBP類蛋白和DNA順式作用元件的結(jié)合特性，目前有兩類DNA作用元件的研究比較清楚，分別是GCC-Box和DRE(失水反應(yīng)元件)。最近，分別來自美國和日本的兩家實驗室相繼報道了他們的研究結(jié)果在擬南芥中過量表達轉(zhuǎn)錄因子基因，通過相應(yīng)的順式作用元件的介導作用，能誘導多個抗逆相關(guān)基因的表達，并顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性(Jaglo-Ottosen等，1998，Science，280104-106；Kasuga等，1999，Nat Biotechnol，17287-291)。這些結(jié)果表明植物抗逆性狀的表達是多個基因參與和協(xié)同表達的結(jié)果。例如，擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子(Liu等，1998，Plant Cell，101391-1406)特異的與基因啟動子中的DRE相互作用并誘導多種脅迫反應(yīng)基因的表達(劉強等；000，科學通報，4511-16)。這類轉(zhuǎn)錄因子具有如下特性第一，DREB受低溫、干旱、高鹽的誘導；第二，受DREB調(diào)控表達的基因啟動子區(qū)都含有DRE或DRE的核心序列(序列為TACCGACAT)，如RD29A(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994，Plant Cell，6251-264)，RD17，KIN1，COR6.6等基因(劉強等，2000，科學通報，4511-16；黃榮峰等，2001，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，992-96)，它受干旱、高鹽及低溫脅迫誘導，但與ABA作用無關(guān)。此外，利用CBF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株研究表明，轉(zhuǎn)錄因子CBF1可以調(diào)控擬南芥、油菜、煙草多種抗低溫基因COR(cold-regulated)的表達(Jagolo-Ottosen等，1998，Science，280104-106；甄偉等，2000，自然科學進展，101104-1108)。表明同一轉(zhuǎn)錄因子可以通過相應(yīng)的順式作用元件同時調(diào)控多個抗逆基因表達(Kasuga等，1999，Nat Biotechnol，17287-291；黃榮峰等，2001，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，992-96；劉強等，2000，科學通報，4511-16)。
GCC-Box是含有保守序列GCCGCC、并受乙烯調(diào)控的功能性順式作用元件(Hao等，1998，Bio Chem，27326857-26861；Fujimoto等，2000，Plant Cell，12393-404)。GCC-Box在大量致病相關(guān)(PR)基因以及其它基因中是相當保守的，如擬南芥PDF1.2和幾丁質(zhì)酶基因(Zhou等，1997，EMBO J，163207-3218；Hao等，1998，Bio Chem，27326857-26861)。轉(zhuǎn)錄因子以位于保守中心堿性區(qū)域N末端的β-片層與GCC-Box結(jié)合(Hao等，1998，Bio Chem，27326857-26861)。不同抗性基因均受EREBP類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(Zhou等，EMBO J，1997，163207-3218；Thara等，1999，Plant J，20475-484；Gu等，2000，Plant Cell，12771-785)。如含EREBP/AP2結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子ORCA2和ORCA3基因的超表達可以明顯地增強與植物防衛(wèi)反應(yīng)密切相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源激素茉莉素(JA)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ORCA2和ORCA3基因的表達，表明此類含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子受到JA的調(diào)控(Menke等，1999，EMBO J，184455-4463；van der Fits和Memelink，2000，Science，289295-297)。Pti4/5/6亦屬于轉(zhuǎn)錄因子AP2/EREBP家族，它們與煙草、番茄等植物對細菌性和真菌性病害的抗性有關(guān)(Zhou等，1997，EMBO J，163207-3218；Thara等，1999，Plant J，20475-484；Fujimoto等，2000，Plant Cell，12393-404；Gu等，2000，PlantCell，12771-785)。綜上所述，通過利用EREBP類轉(zhuǎn)錄因子改變單個或成組基因的表達，不僅可以改進農(nóng)作物的抗旱性、抗鹽性和抗低溫性，還可以提高植物的抗病性(Liu等，1998，Plant Cell，101391-1406；劉強等，2000，科學通報，4511-16；黃榮峰等，2001，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，992-96)。因此，通過遺傳操作，利用抗逆調(diào)控基因表達提高植物抗逆性是一條較單個抗逆功能反應(yīng)基因表達提高植物抗逆性更加有效的新途徑。
本發(fā)明的目的在于通過提供一種編碼番茄乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/AP2 DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子基因的序列，進而構(gòu)建相關(guān)植物表達載體，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化相關(guān)植物如番茄、玉米、油菜、大豆、棉花、水稻、玉米和草坪草等，以使這些植物產(chǎn)生抗逆性。
為獲得與順式調(diào)控元件GCC Box相互作用的編碼AP2 DNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆，本發(fā)明首先構(gòu)建含有GCC Box的報道子篩選番茄cDNA文庫。番茄(Lycopersiconesculentum Miller，麗春栽培種)幼苗cDNA文庫的滴度為3.5×106cfu。在營養(yǎng)缺陷和含有10mM 3-AT培養(yǎng)基上篩選到具有半乳糖苷酶活性的克隆13個。經(jīng)測序和NCBI序列比較表明，其中有2個克隆均編碼1個AP2 DNA結(jié)合域，并與Pti5和擬南芥的EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的AP2 DNA結(jié)合域具有75-84％的同源性，而其它區(qū)域的氨基酸則只有30-36％的同源性；由此2個cDNA克隆推導的氨基酸序列在N端均含有1個堿性的核定位信號區(qū)域，在C端均含有1個酸性的激活區(qū)域，表明我們克隆cDNA為編碼轉(zhuǎn)錄因子的新基因。體內(nèi)結(jié)合實驗表明，此2個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子特異地與GCC-Box順式作用元件作用。由于許多抗逆反應(yīng)基因中都含有GCC-Box順式作用元件，本發(fā)明的結(jié)果表明AP2 DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子新基因可能對含有GCC-Box順式元件的抗逆反應(yīng)基因具有調(diào)控作用。Northern實驗表明，這些克隆的新基因均不同程度地受到乙烯、茉莉素的調(diào)控。本發(fā)明將這2個克隆分別命名為JERF1(jasmonateand ethylene responsive factor)和JERF2。并且，這些新基因也不同程度地受到水楊酸、脫離酸、干旱、低溫(4℃)和鹽堿的調(diào)控，即本發(fā)明克隆的新基因是逆境誘導表達的。
為在植物細胞特別是整株植物中表達外源抗逆基因，以賦予整株植物及其種子和后代以抗逆能力，必須使用適當?shù)姆椒▽y帶JERF基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導到適當?shù)乃拗骷毎蛑参矬w內(nèi)。
將攜帶外源基因的重組載體導入宿主植物或其細胞內(nèi)的方法，包括但并不僅限于(1)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium-mediated transformation)；(2)物理法，如基因槍法(Particle bombardment或Particle gun或Gene gun)、電擊法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纖維介導法(Silicon carbide fiber)、電泳法(Electrophoretictransfection)等；(3)化學法，如PEG介導轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法等；(4)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉介導法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；(5)以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體介導的轉(zhuǎn)化法等。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明選擇番茄和擬南芥作為JERF基因轉(zhuǎn)化的受體植物。具體地說，本發(fā)明涉及編碼JERF基因的DNA序列，涉及所說的DNA序列的高效植物表達載體，涉及用所說的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞、組織和整株植物的方法，以及由此產(chǎn)生的對生物和非生物逆境具有抵抗能力的轉(zhuǎn)基因植物。
在此應(yīng)特別指出的是，雖然在下述實施例中以轉(zhuǎn)基因番茄為例詳細描述了本發(fā)明，但這并不意味本發(fā)明的JERF基因的植物表達載體只限用于轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)具有抗逆能力的轉(zhuǎn)基因番茄。
因此，使用具有本發(fā)明所描述的JERF基因的植物表達載體，以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的任何一種方法導入任何植物或其組織或細胞中，以及由此而獲得的具有任何抗逆能力的植物，及其后代的種子和植物部分，均包括在本發(fā)明之內(nèi)；以該抗逆轉(zhuǎn)基因植物為親本，通過雜交或轉(zhuǎn)育所產(chǎn)生的植株、品系或品種，亦均包括在本發(fā)明之內(nèi)。


圖1.表示JERF1基因DNA保守結(jié)合域的克隆和融會蛋白表達載體的構(gòu)建；圖2.表示JERF1基因DNA保守結(jié)合域與順式作用元件GCC Box的特異性結(jié)合。
將含JERF1基因的pB42AD質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到含野生和突變的GCC box(mGCCbox)元件的YM4271感受態(tài)細胞，如果JERF1與GCC box相互作用，則YM4271可以在不同濃度3-AT和營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基(SD/-His-Ura-Trp)上生長，否則YM4271在10mM 3-AT和營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基(SD/-His-Ura-Trp)不生長。
圖3.表示JERF1(#10克隆)基因的誘導表達分析；番茄幼苗在溫室生長3周后，分別用乙烯、脫落酸、茉莉素、水楊酸以及干旱、低溫(4℃)、鹽堿處理，異硫氰酸胍法提取番茄幼苗總RNA，甲醛瓊脂糖變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜并使RNA固定尼龍膜上，用JERF1全長cDNA(#10克隆)為探針雜交。結(jié)果表明JERF1表達受到乙烯、脫落酸、茉莉素、水楊酸以及干旱、低溫、鹽堿的調(diào)控。EB染色表明各處理樣品上樣量相等。
圖4.表示JERF基因植物表達載體的構(gòu)建；把JERF1全長cDNA序列插入到pROK2植物表達載體BamH1和Smal位點和CaM35S啟動子的下游。
以下敘述本發(fā)明的實施例。應(yīng)當說明的是，本發(fā)明的實施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。
實施例1、番茄JERF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆一、GCC box報告子的構(gòu)建為獲得與順式調(diào)控元件GCC Box相互作用的編碼AP2 DNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆，本發(fā)明首先構(gòu)建含有GCC Box的報告子，即人工合成一段4X17個堿基的重復序列。該17堿基序列含有防衛(wèi)基因PDF1.2啟動子中順式調(diào)控元件GCCGCC的核心序列。將4X17堿基的重復序列分別克隆到pHIS3和pLacZ質(zhì)粒后，同時轉(zhuǎn)化酵母YM4271。經(jīng)營養(yǎng)缺陷和含有10mM 3-AT(HIS3基因產(chǎn)物的競爭抑制劑)培養(yǎng)基篩選，并經(jīng)半乳糖苷酶的活性鑒定后，作為報告子篩選番茄cDNA文庫。
二、番茄cDNA文庫的構(gòu)建番茄(Lycopersicon esculentum Miller，麗春栽培種)種子發(fā)芽后播種在蛭石中，并以1/3 MS培養(yǎng)液培苗，當幼苗在溫室(22-25℃)生長3周后，部分幼苗噴0.05mM的茉莉素(JA)處理48小時?；旌鲜斋@處理和未處理(1∶1)番茄幼苗，并按照GIBCO公司cDNA文庫試劑盒說明，制備番茄cDNA文庫，文庫載體為pB42AD。經(jīng)檢測文庫滴度為3.5×106cfu.
三、制備含報告子的酵母感受態(tài)細胞接種若干個直徑2-3mm的報告子酵母菌株(YM4271)到1ml的YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩使菌落凝塊分散后，轉(zhuǎn)移到盛有50ml YPD的三角瓶中，30℃，250rpm，培養(yǎng)16-18小時至OD600＞1.5。將足夠的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到300ml的YPD中，使OD600＝0.2-0.3，搖床速度230rpm，30℃下繼續(xù)培養(yǎng)3個小時后，5000g離心5分鐘，用25ml 1×TE緩沖液懸浮沉淀，再以5000g離心5分鐘。TE/LiAc中重新懸浮細胞片狀沉淀至總體積為1.5ml。
四、番茄表達型cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含報告子的酵母感受態(tài)細胞將20μg番茄表達型cDNA文庫和2mg鮭精DNA在50ml試管中充分混合(振蕩不要太劇烈)后，加入1ml酵母感受態(tài)細胞和6ml LiAc/PEG，并充分混合。搖床速度200 rpm，30℃下培養(yǎng)30分鐘，加入700μl DMSO并輕微顛倒以充分混合，42℃水浴熱處理15分鐘。冰上冷凍2分鐘，5000g離心5分鐘。棄上清，在兩個50ml離心管中分別用25ml的SD/-His-Ura液體培養(yǎng)基重新懸浮細胞，搖床速度200rpm，30℃下培養(yǎng)3個小時。5000g離心5分鐘，沉淀在7ml的TE緩沖液中懸浮。每塊SD/-His-Ura-Trp平板(含10mM 3-AT)涂布大約500-700 l轉(zhuǎn)化的細胞，共10板，30℃培養(yǎng)4-6天后檢查菌落生長情況，并進行β-半乳糖苷酶活性檢測。
五、從陽性酵母菌中提取酵母質(zhì)粒首先，將表現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性的對應(yīng)單菌落(13個)分別接種到5ml SD/-Leu(含10mM3-AT)液體培養(yǎng)基中，250rpm、30℃下培養(yǎng)20小時。室溫下5000g離心5分鐘，沉淀用pH 8.0的Tris緩沖液洗滌5分鐘，再用200 l的酵母提取液充分整蕩懸浮5分鐘；加入酸洗玻璃珠(200 l)，充分振蕩10分鐘后，再加入200 l苯酚溶液，振蕩5分鐘。12000rpm室溫下離心10分鐘。取上清，加入200 l的苯酚/氯仿/異戊醇振蕩5分鐘，12000rpm室溫下離心10分鐘。上清加入200 l氯仿振蕩5分鐘，12000rpm室溫下離心10分鐘。上清中加入2.5倍體積的100％的乙醇，1/10體積的pH5.2的3M的NaAc，-20℃下放置30分鐘以上，4℃下，12000rpm離心10分鐘。沉淀用500 l 75％的乙醇洗滌，4℃下，12000rpm離心10分鐘后干燥，并用20 l的1×TE緩沖液溶解沉淀。
六、酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細胞及其酶切鑒定取2 l的酵母質(zhì)粒，將其加入到40 l的感受態(tài)大腸桿菌細胞中，混勻后加入到0.1cm電擊杯中，1.8千伏，250μF，電擊(時間為4-5毫秒)后，立即轉(zhuǎn)移到盛有1ml LB的培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩溫育1小時。把混合物在5000rpm離心5分鐘，濃縮菌液到150 l左右，均勻涂布到含有Amp抗性的LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)20小時。接種單菌落于3ml Amp抗性的液體LB中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)過夜，并按堿法提取含有克隆插入片段的pB42AD質(zhì)粒。取1 l含有克隆插入片段的pB42AD質(zhì)粒于1.5ml離心管中，經(jīng)EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切(37℃)1.5個小時，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆插入片段的大小。
實施例2JERF基因的序列分析將含有不同大小的克隆送到測序公司進行序列測定。序列分析表明(見SEQ ID NO1)，命名為JERF1的基因全長1392bp，編碼區(qū)位于87-1202bp，編碼372個氨基酸；AP2 DNA結(jié)合域位于384-563bp。cDNA序列NCBI比較表明，JERF1與水稻EREBP1和EREBP-like protein(tshl)、擬南芥RAP2.12、RAP2.2和RAP2.3全序列有較低的同源性(30％左右)，但在編碼AP2 DNA結(jié)合域部分有80-84％的同源性。根據(jù)JERF1cDNA序列推導的氨基酸序列NCBI比較表明(見SEQ ID NO 2，其中方框內(nèi)部分為AP2 DNA結(jié)合域，雙下畫線部分為堿性核定位信號區(qū)域，陰影部分為酸性激活區(qū)域)，JERF1蛋白與水稻EREBP1和EREBP-like protein(tsh1)、擬南芥RAP2.12、RAP2.2和RAP2.3蛋白有30-36％同源性，但在AP2 DNA結(jié)合域具有75-82％的同源性。由此cDNA克隆推導的氨基酸序列在N端均含有1個堿性的核定位信號區(qū)域，在C端均含有1個酸性的激活區(qū)域，表明JERF1為編碼1個AP2 DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子的新基因。
實施例3JERF1與順式作用元件GCC Box特異結(jié)合的分析一、制備感受態(tài)報告子細胞接種若干個直徑為2-3mm的報告子酵母菌株到1ml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩使菌落凝塊分散，并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到盛有50ml YPD的搖瓶中，搖床速度250rpm，30℃下培養(yǎng)16-18小時至穩(wěn)定期(OD600＞1.5)。將足夠的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到300ml YPD中，使OD600＝0.2-0.3，繼續(xù)在搖床中搖蕩，速度為230rpm，30℃下培養(yǎng)3小時。5000g離心5分鐘，棄上清，用25ml 1×TE緩沖液振蕩，重新懸浮細胞片狀沉淀，將細胞并入一個試管中，再次5000g離心5分鐘，在TE/LiAc中重新懸浮細胞片狀沉淀至總體積為1.5ml，充分混合。
二、轉(zhuǎn)化感受態(tài)報告子細胞準備1×PEG4000/LiAc溶液，在無菌的50ml試管中加入5g含JERF基因的質(zhì)粒和1mg鮭精DNA，充分混合(振蕩不要太劇烈)，另外選擇一空質(zhì)粒作為陰性對照，加入1ml感受態(tài)細胞到DNA混合物中，充分混合后，加入6mlLiAc/PEG4000混合液，高速振蕩10秒鐘以充分混合。搖床速度200rpm，30℃下培養(yǎng)30分鐘，加入350μl DMSO(二甲基亞砜)并輕微顛倒以充分混合。42℃水浴熱休克15分鐘，偶爾搖晃幾下使之混勻，冰上冷凍2分鐘。5000g離心5分鐘，棄上清，在兩個50ml離心管中分別用25ml SD/-His-Ura液體培養(yǎng)基重新懸浮細胞，搖床速度200rpm，30℃下培養(yǎng)3個小時。5000g離心5分鐘。棄上清，在大約1ml的TE緩沖液中重新懸浮細胞，涂布150 l轉(zhuǎn)化的細胞到含有不同濃度的3-AT(3-氨基三唑)SD/-His-Ura-Trp的平板上，30℃培養(yǎng)4-6天。
實施例4JERF1基因的誘導表達分析一、番茄幼苗的培養(yǎng)和處理番茄(Lycopersicon esculentum Miller，麗春栽培種)種子發(fā)芽后播種在蛭石中，以1/3 MS培養(yǎng)液培苗，當幼苗在溫室(22-25℃)生長3周后，定性分析乙烯、脫落酸、茉莉素、水楊酸以及干旱、低溫(4℃)、鹽堿處理對西紅柿基因JERF1表達的影響。
二、異硫氰酸胍法提取番茄幼苗總RNA本方法采用異硫氰酸胍和巰基乙醇兩種RNase抑制劑來抑制RNase的活性，同時，異硫氰酸胍與十二烷基肌胺酸鈉(sarcosyl)共同作用可以破壞核蛋白復合體，使RNA順利地解脫出來溶進緩沖液。由于RNA在堿性條件下不穩(wěn)定，因而在整個提取過程中體系始終保持酸性至中性，但在酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，DNA同蛋白質(zhì)一起變性后被離心下來，RNA則仍溶于上清緩沖液中，最后用異丙醇沉淀出RNA。
三、JERF1基因的Northern表達分析取經(jīng)過不同處理的番茄幼苗總RNA各20μg進行甲醛瓊脂糖(1.0％)變性膠電泳。將膠置于10倍體積的0.05mol/L NaOH中處理15分鐘，然后用BIO-RAD真空電轉(zhuǎn)移儀將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜在2×SSC中漂洗后于室溫下晾干，在紫外交聯(lián)儀上使RNA固定尼龍膜上。
預雜交將結(jié)合有RNA的帶正電荷的尼龍膜置于6×SSC中浸潤2分鐘。放入雜交瓶中，按每平方厘米100μl的量加入預雜交液(預雜交液/雜交液5×SSC，5×Denhardt，1％ SDS，100μ/ml變性鮭精DNA)，置雜交爐內(nèi)，65℃溫育2小時。
探針的制備(采用Prime-a-gene labeling kit，Promega，公司地址，國別)從含有JERF1基因的pB42AD中用EcoRI+XhoI雙酶切回收JERF1基因片段。在500μl離心管中依次加入下列試劑5×標記緩沖液10μl，dNTP混合物(無dCTP)2μl，變性DNA模板25ng，10mg/ml BSA 2μl，α-32P-dCTP 5μl，Klenow酶1μl(5U/μl)，加重蒸水至50μl?；靹蚝笤谑覝叵路磻?yīng)60分鐘，在沸水中變性2分鐘后立即置于冰水中，加EDTA至20 mM。
雜交在預雜交液中加入熱變性的探針，65℃雜交過夜。
洗膜取出尼龍膜，在2×SSC、0.1％ SDS中于室溫洗膜2次，每次5分鐘。然后在1×SSC、0.1％SDS中65℃洗膜1次，每次10分鐘。然后再在0.1×SSC、0.1％SDS中于65℃洗膜1-2次，每次15分鐘。最后在2×SSC中漂洗，用濾紙吸干液體，用保鮮膜包裹，進行放射自顯影。
實施例5JERF1根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建從含JERF基因的pB42AD質(zhì)粒上用PCR擴增JERF基因，并連接到pBluscriptIISK的SmaI位點。用BamHI和EcoRV雙酶切純化后連接到pROK2表達載體，命名為pROK-JERF質(zhì)粒，鑒定后轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中。首先將農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基中，28℃、250rpm搖菌培養(yǎng)至OD600約0.6。將菌液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，冰浴30分鐘，然后5000rpm離心5分鐘。棄上清，沉淀用2ml 20mM CaCl2懸浮，把每份100ul分裝到1.5ml離心管中，在液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ?μg pROK-JERF質(zhì)粒DNA，加入到100ul感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴5分鐘。把離心管置液氮中冷凍5分鐘，迅速轉(zhuǎn)至37℃水浴中溫浴5分鐘。加入1ml YEB培養(yǎng)基，28℃、250rpm搖菌培養(yǎng)4-5小時。取適量菌液涂布于含抗生素的YEB平板上，28℃培養(yǎng)24-48小時。附本發(fā)明涉及的基因序列和蛋白質(zhì)序列1.SEQ ID NO 1(JERF1基因序列)1TTCAAATTGA GCTTTTTCTC CATTAAAATT CTCTCTGCAA ATTTATAGTT TTTCTTTTTT61 CACTTTTTGA GAAGAAATCA AAAGCTATGT GTGGTGGTGC AATTATCTCC GATTTGGTAC121 CTCCTAGCCG GATTTCTCGC CGGTTAACCG CTGATTTTCT ATGGGGTACA TCCGATCTGA181 ACAAGAAGAA GAAGAACCCT AGTAATTACC ACTCAAAGCC CTTGAGGTCT AAGTTTATTG241 ACCTTGAAGA TGAATTTGAA GCTGACTTTC AGCACTTCAA GGATAATTCT GATGATGATG301 ATGATGTGAA GGCATTTGGC CCCAAATCCG TGAGATCTGG TGATTCAAAC TGCGAAGCTG361 ACAGATCCTC CAAGAGAAAG AGGAAGAATC AGTACCGGGG ATCAGACAGC GTCCTTGGGG421 TAAGTGGGCA GCTGAAATAC GTGATCCAAG GAAAGGTATT CGAGTCTGGC TTGGTACTTT481 CAATTCAGCC GAAGAGGCAG CCAGAGCTTA TGATGCTGAG GCGCGAAGGA TCAGAGGCAA541 GAAAGCTAAG GTGAACTTTC CTGATGAAGC TCCAGTGTCT GTTTCAAGAC GTGCTATTAA601 GCAAAATCCC CAAAAGGCAC TTCGTGAGGA AACCCTGAAC ACAGTTCAGC CCAACATGAC661 TTATATTAGT AACTTGGATG GTGGATCTGA TGATTCGTTC AGTTTTTTCG AAGAGAAACC721 AGCAACCAAG CAGTACGGCT TCGAGAATGT GTCTTTTACT GCTGTAGATA TGGGACTGGG781 CTCAGTTTCC CCTTCAGCTG GTACAAATGT TTACTTCAGC TCTGATGAAG CAAGTAACAC841 TTTTGACTGC TCTGATTTCG GTTGGGCTGA ACCGTGTGCA AGGACTCCAG AGATCTCATC901 TGTTCTGTCG GAAGTTCTGG AAACCAATGA GACTCATTTT GATGATGATT CCAGACCAGA961 GAAAAAACTG AAGTCCTGTT CCAGCACTTC ATTGACAGTT GACGGTAACA CTGTGAACAC1021 GCTATCTGAA GAGCTATCGG CTTTTGAATC CCAGATGAAG TTCTTGCAGA TCCCATATCT1081 CGAGGGAAAT TGGGATGCAT CGGTTGATGC CTTCCTCAAT ACAAGTGCAA TTCAGGATGG1141 TGGAAACGCC ATGGACCTTT GGTCCTTCGA TGATGTACCT TCTTTAATGG GAGGTGCCT1201 ACTAAGCTG CATACACATC TTCCCCTGCT AAGTTTTGTA AATAACGCTT CATTTGAGTG1261 AAGTTTGCGC CTGCGTTTAC GTTTATCACC AAACTAAAAG ACTATATATG TGTTGTATTA1321 ATTTATTCAA AATTTACTCG TTTGATATAT GTAAGTATGT ATCCTTGTTT TCATAAAAAA1381 AAAAAAAAAA AA2.SEQ ID NO 2(JERF1基因序列編碼的氨基酸序列)1MCGGAIISDL VPPSRIS L TADFLWGTSD LN NPSN YHSKPLRSKFI DLEDEFEAD61FQHFKDNSDD DDDVKAFGPK SVRSGDSNCE ADRSS NQ 121DEAPVSVSRRA IKQNPQKALR181EETLNTVQPNMTYISNLDGGSDDSFSFFEEKPATKQYGFENVSFTAVDMG LGSVSPSAGT241 NVYFSSDEAS NTFDCSDFGW AEPCARTPEI SSVLSEVLET NETHFDDDSRPEKKLKSCSS301 TSLTVDGNTV NTLSEELSAF ESQMKFLQIV NTLSEELSAF ESQMKFLQIQDGGNAMDLWS361 FDDVPSLMGG AY
權(quán)利要求
1.一種編碼番茄轉(zhuǎn)錄因子的基因序列，其特征是該序列具有如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，且編碼具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
2.權(quán)利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的部分序列；
3.權(quán)利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的同源序列；
4.權(quán)利要求1的基因序列，其中所說的基因序列具有誘導基因表達的特性；
5.權(quán)利要求1的基因序列，其中所說的蛋白質(zhì)含有一個由57個氨基酸組成的乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/AP2 DNA結(jié)合域；
6.一種植物基因表達載體，其特征是該植物基因表達載體含有權(quán)利要求1-3的基因序列，且能夠用于轉(zhuǎn)化有關(guān)植物使之產(chǎn)生抗逆性；
7.權(quán)利要求6的植物基因表達載體，其中所說的有關(guān)植物包括雙子葉植物和單子葉植物；
8.權(quán)利要求6的植物基因表達載體，其中所說的有關(guān)植物是棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木和花草；
9.權(quán)利要求6的植物基因表達載體，其中所說的抗逆性包括抗干旱、抗低溫和抗鹽堿的特性；
10.權(quán)利要求6的植物基因表達載體，其中所說的轉(zhuǎn)化包括利用農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法、共轉(zhuǎn)化法和基因槍法進行的轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種番茄編碼乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/AP2 DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子的基因及其在轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用。進一步，通過提供包括番茄編碼乙烯反應(yīng)結(jié)合蛋白/AP2DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子基因的序列，進而構(gòu)建相關(guān)植物表達載體，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化相關(guān)植物如番茄、玉米、油菜、大豆、棉花、水稻、玉米和草坪草等以使這些植物產(chǎn)生抗逆性。
文檔編號C12N15/87GK1393560SQ01119828
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者黃榮峰, 劉強, 謝丙炎, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所