半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物抗逆生理學(xué)，具體涉及半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法。所述方法包括以下步驟：1)對(duì)半野生棉種子進(jìn)行濃硫酸脫絨，然后消毒；2)制備復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)；3)播種；4)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析，評(píng)價(jià)棉花半野生棉材料的抗性水平。該方法可以迅速準(zhǔn)確的篩選出高抗鹽堿的半野生棉材料，抗性穩(wěn)定，不僅能忍受單一的鹽脅迫，更能適應(yīng)復(fù)雜多變的實(shí)際逆境，因而更有實(shí)踐利用價(jià)值和意義。
【專利說明】
半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物抗逆生理學(xué)，具體涉及半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 半野生棉（semi-wild cotton)是陸地棉野生種系，未經(jīng)人工馴化過，產(chǎn)于中美洲 的墨西哥高地和加勒比海地區(qū)，存在有豐富的抗逆基因源。
[0003] 現(xiàn)如今關(guān)于棉花抗鹽性的研究大多集中在單一鹽(NaCl)上，然而自然界的環(huán)境中 往往是多種鹽復(fù)合存在，并且鹽與堿混合伴生，這樣造成了單一鹽研究的結(jié)果在實(shí)踐中收 不到預(yù)期的結(jié)果，不能解決實(shí)踐問題。我國新疆地區(qū)存在很大面積的鹽堿土，并且具有復(fù)雜 的鹽堿環(huán)境，其特點(diǎn)是鹽堿離子成分多、積鹽重、面積大。
[0004]目前棉花栽培品種耐鹽堿性篩選方法主要為萌發(fā)期出苗率鑒定方法，此方法為大 田篩選法且主要針對(duì)栽培棉種，半野生棉材料中存在有部分材料的種殼堅(jiān)硬，自然萌發(fā)率 低的現(xiàn)象。同時(shí)大田鑒定方法存在大田鹽分分布不均勻、受環(huán)境影響大、鑒定周期長(45天 左右)等缺點(diǎn)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。而且僅用發(fā)芽率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，過于單一，結(jié)果受主 觀影響大。因此，探索一種適合半野生棉萌發(fā)期鹽堿抗性的標(biāo)準(zhǔn)方法和評(píng)價(jià)體系，以迅速準(zhǔn) 確的篩選出高抗鹽堿的半野生棉材料，抗性穩(wěn)定、可靠，不僅能忍受單一的鹽脅迫(NaCl)， 更能適應(yīng)復(fù)雜多變的實(shí)際逆境(如多離子毒害、堿脅迫），因而更有實(shí)踐利用價(jià)值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，用來彌補(bǔ)棉花鹽堿 抗性篩選方法的不足，以期能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)棉花半野生種質(zhì)資源的進(jìn)行客觀鑒定，為棉 花抗鹽堿育種的培育提供依據(jù)。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟：
[0007] 1)對(duì)半野生棉種子進(jìn)行濃硫酸脫絨，然后消毒，清水沖洗晾干，加熱干燥以打破種 子休眠，在種子珠孔端切一個(gè)小口，以不傷害胚根為準(zhǔn)；
[0008] 2)制備復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì):選擇直徑為0.05mm~0.80mm的沙子，洗滌，滅菌，烘干， 配制復(fù)合鹽堿溶液，按照復(fù)合鹽堿溶液/干沙子質(zhì)量比16 %混勻，作為復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)， 其中所述復(fù)合鹽堿溶液配制方法如下：
[0009] 1L復(fù)合鹽堿溶液按質(zhì)量包括2.67g CaCl2,〇.18g NaHC03,5.01g Na2S〇4,〇.42g K2S04,3.59g MgS04 · 7H20,PH=7.5；
[0010] 3)播種:在上述步驟2)制備的復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)步驟1)處理過的半野生棉 棉種，置于溫度28°C，濕度85%，光照12h，黑暗12h的條件的溫室中，培養(yǎng)14天；
[0011] 4)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析:待生長至14天時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，對(duì)每株棉苗的受害情況調(diào)查和 評(píng)分，評(píng)價(jià)棉花半野生棉材料的抗性水平。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，包括以下 步驟：
[0013] 1、種子的前處理:種子硫酸脫絨，NaCIO消毒處理種子并置40度烘箱24h打破種子 休眠，選擇籽粒飽滿成熟的種子，用單面刀片在種子合點(diǎn)端(鈍端)切小口，大小ImmX 1mm， 種殼切破露出種仁即可。
[0014] 2、制備復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì):選擇直徑為0.05mm~0.80mm的沙子，洗滌，滅菌，烘干； 配置鹽堿處理液，按照質(zhì)量比16% (水/干沙子）的含水量與配制的復(fù)合鹽堿溶液混勻作為 鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)；對(duì)照基質(zhì)按照質(zhì)量比16% (水/干沙子）加入無菌水，混勻作為對(duì)照培養(yǎng)基 質(zhì)；
[0015] 3、播種并培養(yǎng)棉苗:發(fā)芽盒下層鋪合適厚度的沙子，每盒播種6行，每行5粒，每兩 行一個(gè)材料(或重復(fù)），蓋上合適厚度的沙子，置于溫度28°C，濕度85%，光照12h，黑暗12h的 條件下，培養(yǎng)14天；
[0016] 現(xiàn)有的鑒定棉花鹽堿抗性的方法未有關(guān)于溫室之內(nèi)進(jìn)行棉花鹽堿抗性鑒定的報(bào) 道，本發(fā)明為專門針對(duì)半野生棉材料中有部分材料存在種殼較硬的情況進(jìn)行的特別優(yōu)化， 如果采用生產(chǎn)上棉花常規(guī)育苗方法，部分半野生棉不能正常發(fā)芽;本發(fā)明專門為溫室內(nèi)鑒 定鹽堿抗性設(shè)計(jì)的復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)。因?yàn)槟壳暗蔫b定方法均為大田鑒定方法，沒有進(jìn)行 溫室之內(nèi)鑒定鹽堿抗性的先例，該復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)法為針對(duì)大田中土壤鹽分含量不均的 情況;本發(fā)明采用的發(fā)芽盒種植方法是針對(duì)大田中氣候變化無常，水分散失過快的情況做 的優(yōu)化;抗性分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是專門根據(jù)本專利方法進(jìn)行的數(shù)字化指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
[0017] 4、統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析:最后一天統(tǒng)計(jì)每一個(gè)半野生棉材料的出苗率以及針對(duì)每一株 棉苗進(jìn)行評(píng)分。對(duì)每一株棉苗進(jìn)行客觀分級(jí)評(píng)分是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。根據(jù)出苗率和評(píng)分結(jié)果對(duì) 半野生棉抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0018] 本發(fā)明為半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 1、首次進(jìn)行室內(nèi)半野生棉復(fù)合鹽堿抗性的鑒定，這種鑒定方法更貼近大田鹽堿地 的真實(shí)情況，而且材料和沙子經(jīng)過前期滅菌處理，避免了細(xì)菌的干擾，實(shí)驗(yàn)中對(duì)照材料出苗 均勻一致，根系發(fā)育完整，萌發(fā)期一致，保證了鑒定的準(zhǔn)確性。
[0020] 2、首次選用化合物配方模擬大田鹽堿地的鹽堿環(huán)境和完全混勻一致的復(fù)合鹽堿 培養(yǎng)基，這樣相較于大田鑒定來說減少了因?yàn)樘锏氐柠}堿含量不均勻所導(dǎo)致的鑒定結(jié)果不 準(zhǔn)確性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
[0021] 3、該方法不受季節(jié)控制，鑒定周期短，可短時(shí)間鑒定棉花材料或品種的鹽堿抗性。 半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，鑒定周期為14天，播種后第14天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，統(tǒng)計(jì) 每株棉苗的生長狀況進(jìn)行評(píng)分。較大田鑒定(45天左右)縮短30天，可快速進(jìn)行材料萌發(fā)期 鹽堿抗性篩選，為加速抗逆育種提供技術(shù)支持。
[0022] 4、投入的人力物力小，省工又經(jīng)濟(jì)。半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，使用 商品河沙、分析純?cè)噭┖头N子發(fā)芽盒，而且都是經(jīng)過高溫消毒，省去大量的人力和物力的投 入，可進(jìn)行大批量材料的鑒定;易于推廣和利用。
【附圖說明】
[0023]圖1棉苗抗性分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。
[0024]圖2對(duì)照處理組和復(fù)合鹽堿處理組半野生棉材料的萌發(fā)情況對(duì)比：l_a，陸地棉（中 16)正常萌發(fā)。1-b，半野生棉(瑪麗加朗特棉85)正常萌發(fā)。1-c，半野生棉（闊葉棉40)正常萌 發(fā)。2-a，陸地棉（中16)發(fā)芽率為70%，然而僅有3株幼苗生長正常，其余四株受害嚴(yán)重，綜合 重復(fù)情況耐鹽堿水平為抗，2-b，半野生棉(瑪麗加朗特棉85)沒有明顯的受害特征，生長良 好，耐鹽堿水平為高抗。2-c，半野生棉（闊葉棉40 )，僅有一粒種子發(fā)芽，受害嚴(yán)重，耐鹽堿水 平為高感。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1采用半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法對(duì)半野生棉（闊葉棉40、闊葉 棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉85)以及栽培棉（中12、中16、鄂荊一 號(hào)、7124)的耐鹽堿水平進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)。
[0026] 1、棉花材料：
[0027] 半野生棉（闊葉棉40、闊葉棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉 85 )，陸地棉（中12、中16、鄂荊一號(hào)），海島棉(7124)為栽培棉對(duì)照材料。
[0028] 2、種子的前處理：
[0029] 將所有帶短絨的種子進(jìn)行硫酸脫絨，挑選大小一致，烏黑飽滿、無蟲害的完整的成 熟種子再用5 %次氯酸鈉溶液浸泡10分鐘，清水洗凈，晾干，置40度烘箱中加熱干燥24h以打 破種子休眠，然后單面刀片將半野生棉的種子珠孔端(尖端)切小口，露出種仁即可在切一 小口，以不傷害胚根為準(zhǔn)。
[0030] 3、制備復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)：
[0031 ] 選擇直徑為0.05mm~0.80mm的沙子，洗滌，滅菌，烘干;配置鹽堿處理液，用NaOH調(diào) 整PH至7.5，按照質(zhì)量比16% (水/干沙子)的含水量與設(shè)計(jì)好的混合鹽堿溶液混勻作為鹽堿 培養(yǎng)基質(zhì);對(duì)照處理按照質(zhì)量比16% (水/干沙子)加入無菌水，混勻作為對(duì)照培養(yǎng)基質(zhì)。 [0032]混合鹽堿溶液配制方法如下：
[0033]
[0034] 4、置床培養(yǎng)：
[0035]選用12Cm*19Cm*13cm的發(fā)芽盒，首先在發(fā)芽盒底部鋪上一層厚度約為（10-20)mm 的基質(zhì)，抹平，種子均勻播在濕砂上，每盒6排，每排5粒，粒與粒之間保持一定的距離，每兩 排一個(gè)材料，最后上部加蓋（10-15)mm濕砂，抹平，蓋上蓋子，置于溫度28°C，濕度85%，光照 12h，黑暗12h的條件下，培養(yǎng)14天；
[0036]按同樣的方法設(shè)置對(duì)照組。
[0037] 5、統(tǒng)計(jì)與抗性分級(jí)：
[0038] 第14日調(diào)查半野生棉萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。同時(shí)根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)度每一株棉苗進(jìn) 行評(píng)分。耐鹽堿水平分級(jí):按照本發(fā)明的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每個(gè)材料進(jìn)行評(píng)分，依據(jù)
[0039] 公式計(jì)算耐鹽堿指數(shù)，對(duì)材料的耐鹽堿水平進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果見表2:
[0041]
[0040] 表2:半野生棉耐鹽堿水平評(píng)價(jià)結(jié)果
[0043] 2013年新疆鹽堿次生鹽堿地塊篩選結(jié)果[0044]
[0042]
[0045]~2015年新疆鹽堿次生鹽堿地塊篩選結(jié)果
[0046]
[0047]
[0048] 田間數(shù)據(jù)只有出苗率一種指標(biāo)作為評(píng)價(jià)抗性的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)由于地塊中的鹽分變 化、氣候、土壤含水量等的不確定性往往會(huì)造成每年重復(fù)之間出苗率不一樣，但是按照抗性 排名進(jìn)行抗性分級(jí)的抗性趨勢是一致的。
[0049] 本試驗(yàn)的方法為進(jìn)過多次改進(jìn)優(yōu)化的方法，優(yōu)化配方過程如下：
[0050] (第一次優(yōu)化）1L復(fù)合鹽堿溶液按質(zhì)量包括5.66g Ca(N〇3)2 · 4H20 2， 0.152gNaHC03,5.01g Na2S〇4,7.99g K2S〇4,5.94g MgS〇4.7H20，PH = 8;此配方造成了闊葉 棉32發(fā)芽率十分低、中S9612出苗率十分高，無法與大田抗性趨勢一致。
[0051]

[0052] (第二次優(yōu)化）1L復(fù)合鹽堿溶液按質(zhì)量包括0.46g NaCl，0.152g NaHC03， 2.73gNa2S〇4,2.67g CaCl2,5.44g MgS〇4· 7H20，PH=8;此配方造成了闊葉棉32發(fā)芽率十分 低，無法與大田抗性趨勢一致。此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每個(gè)材料的相對(duì)發(fā)芽率均偏高，無法進(jìn)行準(zhǔn)確 判斷。
[0053]
[0054]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 半野生棉萌發(fā)期復(fù)合鹽堿抗性鑒定方法，其特征在于，所述方法包括W下步驟： 1) 對(duì)半野生棉種子進(jìn)行濃硫酸脫絨，然后消毒，清水沖洗驚干，加熱干燥W打破種子休 目民，在種子珠孔端切一個(gè)小口，W不傷害胚根為準(zhǔn)； 2) 制備復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì):選擇直徑為0.05mm~0.80mm的沙子，洗涂，滅菌，烘干，配制 復(fù)合鹽堿溶液，按照復(fù)合鹽堿溶液/干沙子質(zhì)量比16 %混勻，作為復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)，其中 所述復(fù)合鹽堿溶液配制方法如下： 1L復(fù)合鹽堿溶液按質(zhì)量包括2.67g CaCl2,0.18g 化HC〇3,5.01g 化2S〇4,0.42g K2SO4， 3.59g MgS〇4 · 7出0，PH=7.5; 3) 播種：在上述步驟2)制備的復(fù)合鹽堿培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)步驟1)處理過的半野生棉棉 種，置于溫度28°C，濕度85%，光照12h，黑暗12h的條件下，培養(yǎng)14天； 4) 統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析:待生長至14天時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，對(duì)每株棉苗的受害情況調(diào)查和評(píng) 分，評(píng)價(jià)棉花半野生棉材料的抗性水平。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟4)中，按照W下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)棉花受害情 況調(diào)查和評(píng)分： 0分-未萌發(fā)種子； 1分-種子剛破上、未破殼； 2分-種子未破殼，但已生長至正常高度和種子剛破±，但已破殼； 3分-棉苗未至正常高度，子夜卷曲、發(fā)黃； 4分-棉苗正常生長，子葉展開。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟4)中，W耐鹽堿指數(shù)評(píng)價(jià)棉花半野 生棉材料的抗性水平， 耐鹽堿指數(shù)計(jì)算公式為： 耐盛堿騰數(shù)=其中，Στ康示處理組，Σ〇(表示對(duì)照組，f為該級(jí)別的株數(shù)，X為相應(yīng)級(jí)別的分值，范圍為 0-4, η為播種數(shù)。
【文檔編號(hào)】A01C1/02GK106069243SQ201610395489
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日 公開號(hào)201610395489.6, CN 106069243 A, CN 106069243A, CN 201610395489, CN-A-106069243, CN106069243 A, CN106069243A, CN201610395489, CN201610395489.6
【發(fā)明人】韋洋洋, 李振慶, 許艷超, 周忠麗, 劉方, 蔡小彥, 王星星, 王玉紅, 王春英, 張振梅, 王坤波
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所