一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，該方法的主要內(nèi)容包括，菲律賓蛤仔親貝經(jīng)充分促熟，催產(chǎn)后，親貝單個(gè)排放配子；選擇未被污染、成熟度高的精卵，通過人工授精獲得受精卵；受精后13min，加入細(xì)胞松弛素CB處理，處理濃度為0.5mg/L，抑制第一極體釋放，受精后19min，洗卵，去除CB；將受精卵置于適宜條件下發(fā)育，獲得四倍體菲律賓蛤仔胚胎；處理過程及發(fā)育過程所用海水為砂濾海水，鹽度24?26，溫度24.8?25℃。本發(fā)明利用最佳的精、卵，有效提高了受精卵的發(fā)育同步性，顯著提高了四倍體誘導(dǎo)率，流式細(xì)胞術(shù)檢測的誘導(dǎo)率穩(wěn)定在50％以上。
【專利說明】
一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)中貝類遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及染色體工程，特別是一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菲律賓蛤仔Ruditapes philippenarum俗稱花蛤、蜆子，屬雙殼類，簾蛤科，蛤仔屬，為廣溫、廣鹽性種類，我國重要經(jīng)濟(jì)貝類，目前已成為世界性養(yǎng)殖貝類。2014年蛤仔產(chǎn)量約占海水貝類產(chǎn)量的1/3，為我國單種養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的貝類，產(chǎn)業(yè)地位十分重要。目前，在養(yǎng)殖中主要采用野生苗種，導(dǎo)致個(gè)體小型化、抗逆性差、繁殖季節(jié)死亡率高、單位產(chǎn)量降低。
[0003]三倍體貝類因其不育性而具有生長速度快、成活率高、肉質(zhì)佳等優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，三倍體菲律賓蛤仔苗種的應(yīng)用，有望克服其在養(yǎng)殖中出現(xiàn)的問題，利用四倍體與二倍體雜交，可培育全三倍體貝類，是實(shí)現(xiàn)三倍體貝類產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。
[0004]菲律賓蛤仔三倍體的誘導(dǎo)方法已經(jīng)公開，但四倍體貝類的誘導(dǎo)在原理、技術(shù)方法以及胚胎發(fā)育的環(huán)境因素控制方面均與三倍體誘導(dǎo)存在本質(zhì)區(qū)別。另外，由于抑制PBl對(duì)個(gè)體胚胎發(fā)育的負(fù)面影響顯著高于抑制PB2，因此，在對(duì)菲律賓蛤仔進(jìn)行四倍體的誘導(dǎo)時(shí)，必須考慮到維持胚胎發(fā)育的最適環(huán)境因素，以提高四倍體誘導(dǎo)率以及胚胎發(fā)育的成功率，因此必須通過研究確定好最佳溫、鹽、照度等主要環(huán)境因素。
[0005]通過物理、化學(xué)以及生物等方法抑制PBl釋放是誘導(dǎo)貝類四倍體的基本方法，其中，細(xì)胞松弛素B(CB)是一種常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，CB誘導(dǎo)法操作流程短、倍化率高。目前，已對(duì)長牡蠣、櫛孔扇貝、紫貽貝、馬氏珠母貝等多種貝類開展四倍體育種相關(guān)研究，其中牡蠣類已培育出四倍體成貝，形成了牡蠣多倍體產(chǎn)業(yè)。對(duì)菲律賓蛤仔的四倍體誘導(dǎo)有以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):對(duì)受精階段和早期胚胎階段的環(huán)境條件的嚴(yán)格控制，特別是溫度、鹽度、PH、光照強(qiáng)度等對(duì)胚胎發(fā)育速度和畸形率影響顯著的環(huán)境因子;對(duì)精卵的嚴(yán)苛選擇，精卵必須充分發(fā)育，同步受精，提高受精過程及胚胎發(fā)育過程的同步性;對(duì)受精卵處理時(shí)間、處理時(shí)長和處理強(qiáng)度的精確控制。目前，國外曾有研究菲律賓蛤仔的四倍體誘發(fā)，但對(duì)于上述條件掌握不當(dāng)，導(dǎo)致誘導(dǎo)率較低，且不穩(wěn)定，未能形成成熟的菲律賓蛤仔四倍體誘導(dǎo)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，能夠穩(wěn)定、高效的制備菲律賓蛤仔四倍體胚胎。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]—種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，具體包括步驟如下:
[0009](I)選擇菲律賓蛤仔親貝，人工促熟或自然成熟；
[0010](2)親貝陰干4h，置入砂濾海水催產(chǎn)，將開始排放配子的親貝撿出，淡水沖洗10-30s，單個(gè)置于燒杯，繼續(xù)排放配子，排放完畢立即撿出親貝；
[0011](3)鏡檢每杯產(chǎn)物，選擇卵子發(fā)育良好、未被精子污染的卵液合并，卵液以ΙΟΟμπι篩絹過濾去除組織碎片，25μπι篩絹收集待用；
[0012](4)選擇活力良好的精子懸濁液，用25μπι篩絹濾除組織碎肩，收集下層液；
[0013](5)按精卵數(shù)量比3:1-6:1，將精子迅速加入卵子懸液，迅速攪動(dòng)卵液使之均勻受精，控制受精卵濃度在800-1000粒/mL;
[0014](6)受精后13min，向受精卵加入CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液，維持受精卵保持懸浮狀態(tài)；
[0015](7)受精后19min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵15-20S，去除CB;
[0016](8)受精卵重新懸浮于砂濾海水中進(jìn)行胚胎發(fā)育，培育密度15-20枚卵/ml;
[0017](9)受精后24h，胚胎發(fā)育至D形幼蟲階段，四倍體胚胎制備完成，用流式細(xì)胞術(shù)測定四倍體誘導(dǎo)率；
[0018](10)對(duì)上述步驟中所使用的砂濾海水進(jìn)行紫外線照射30-60min，控制砂濾海水溫度為24.8-25 °C，鹽度為24-26，pH值為8.0。
[0019]而且，所述親貝為2-3齡，殼面花紋清晰，殼長大于4cm的菲律賓蛤仔。
[0020]而且，整個(gè)試驗(yàn)期間，環(huán)境照度低于401ux。
[0021]而且，所述發(fā)育良好的卵子，指卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好;所述活力良好的精子指，鏡下檢查，分散度好、游動(dòng)迅速，多98%的精子具有正?；顒?dòng)能力。
[0022]而且，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中。
[0023]而且，所述胚胎發(fā)育，應(yīng)維持水體微充氣，每隔Ih攪動(dòng)水體至浮游期，胚胎保持懸浮狀態(tài)。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0025]本發(fā)明首次公開了一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，具有穩(wěn)定高效、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)比以往針對(duì)海水雙殼類的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，本發(fā)明有如下創(chuàng)新效果:
[0026]1、采卵方法不同:以往對(duì)菲律賓蛤仔進(jìn)行精、卵采集，一般采用混合催產(chǎn)，精卵排放后即行受精，導(dǎo)致受精過程同步性差，誘導(dǎo)率低，胚胎畸形率高，本發(fā)明采用單一個(gè)體催廣，可對(duì)精卵進(jìn)彳丁精確的人工選擇，有效提尚受精過程的同步性；
[0027]2、處理方法不同:本發(fā)明對(duì)配子進(jìn)行了嚴(yán)格篩選，精確把握受精卵的處理時(shí)間及處理強(qiáng)度，適度延長了處理時(shí)長，顯著提高了四倍體誘導(dǎo)率；
[0028]3、前期誘導(dǎo)與后期發(fā)育相結(jié)合:本發(fā)明在綜合研究了菲律賓蛤仔四倍體誘導(dǎo)的最佳條件及四倍體胚胎發(fā)育的適宜環(huán)境因子的基礎(chǔ)上提出，對(duì)比以往只關(guān)注誘導(dǎo)率的四倍體誘導(dǎo)方法(例如實(shí)施例6)，本發(fā)明具有幼蟲孵化率及存活率高、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；
[0029]4、獲得結(jié)果不同:以往在其他雙殼類的四倍體誘導(dǎo)率在25-50%間變化，而本發(fā)明的四倍體誘導(dǎo)率穩(wěn)定在50 %以上。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下對(duì)本發(fā)明實(shí)施做進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]實(shí)施例1
[0032](1)2013年6月初，在河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院某基地，利用在某灘涂采捕的2齡蛤仔作為親貝，親貝殼長41.1 ±3.2mm，在室內(nèi)進(jìn)行30天促熟，性腺充分成熟；
[0033](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體50L，海水為經(jīng)紫外線照射30min的砂濾海水，親貝陰干4h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，1min后開始有親貝排放配子，將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有500mL海水的燒杯內(nèi)，約1min后，配子基本排放完畢，獲得卵液11杯，精液12杯；
[0034](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子約200萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有ISOOmL海水的塑料燒杯；
[0035](4)鏡檢每杯精液，其中6杯中90%以上的精子具有正?；顒?dòng)能力，且分散度良好，但其中兩杯精子游動(dòng)速度最快，選擇這兩杯中濃度較高的一杯，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，備用；
[0036](5)取15mL精子，迅速加入(3)步所得卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-5個(gè)精子，向燒杯中加入砂濾海水至水體2000mL;
[0037](6)受精后13min，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，受精卵I3Bl未出現(xiàn)；
[0038](7)受精后19min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵20s，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度18粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率77.8%；
[0039](8)利用步驟(7)中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為52.2%。
[0040](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度為25°C，鹽度24.5，pH8.0，環(huán)境照度201ux。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042](1)2015年5月底，在青島某貝類苗種繁育場，利用本地池塘采捕的2齡蛤仔作為親貝，親貝殼長41.8± 3.8mm，自然狀態(tài)下基本發(fā)育成熟，在室內(nèi)經(jīng)過一周左右的強(qiáng)化，性腺充分成熟；
[0043](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體30L，海水為經(jīng)紫外線照射50min的砂濾海水，親貝陰干4h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，每隔Imin充氣lmin，6min后開始有親貝排放配子，將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有500mL砂濾海水的燒杯內(nèi)，約8min后，配子基本排放完畢，獲得卵液8杯，精液5杯；
[0044](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液2杯合并，得卵子約160萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有ISOOmL海水的塑料燒杯；
[0045](4)鏡檢每杯精液，其中4杯中90%以上的精子具有正?；顒?dòng)能力，且分散度良好，但其中I杯精子游動(dòng)速度最快，選擇這杯精液，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，得到精液2 OmL，備用；
[0046](5)取13mL精子，迅速加入卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-6個(gè)精子，繼續(xù)向燒杯中加入砂濾海水，至水體2000mL ；
[0047](6)受精后13min，向受精卵中加入2mL CB溶液(CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中)，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，受精卵PBl未出現(xiàn)；
[0048](7)受精后19min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵15s，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度20粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率75.2%；
[0049](8)利用步驟(7)中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為56.1%。
[0050](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度控制為24.9°C，鹽度26，pH8.0，環(huán)境照度251ux。
[0051 ] 實(shí)施例3
[0052](1)2015年6月初，在天津市某水產(chǎn)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，利用渤海灣淺海采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長43.2 ± 3.2mm，性腺自然成熟；
[0053](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體30L，海水為經(jīng)紫外線照射30min的砂濾海水，親貝陰干4h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，每隔Imin間斷充氣lmin，8min后開始有親貝排放配子，將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有500mL砂濾海水的燒杯內(nèi)，約Smin后，配子基本排放完畢，獲得卵液12杯，精液4杯；
[0054](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子約300萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有2800mL海水的塑料燒杯；
[0055](4)鏡檢每杯精液，其中I杯精子游動(dòng)速度最快，且分散良好，選擇這杯精液，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，得到精液100mL，備用；
[0056](5)取25mL精子，迅速加入卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-5個(gè)精子。繼續(xù)向盛有受精卵的燒杯中加入砂濾海水，至水體3000mL；
[0057](6)受精后13min，向受精卵中加入3mL CB溶液(CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中)，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，受精卵PBl未出現(xiàn)；
[0058](7)受精后19min，迅速將受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵15s，去除CB;受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度15粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率77.3% ；
[0059](8)利用步驟7中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為53.8%。
[0060](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度為24.8°C，鹽度25，pH8.0，環(huán)境照度351ux。
[0061 ] 實(shí)施例4
[0062](1)2016年5月底，在天津某公司苗種繁育車間，利用堿河口灘涂采捕的3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長42.9 ± 2.8mm，自然狀態(tài)下基本發(fā)育成熟，在室內(nèi)經(jīng)過一周左右的強(qiáng)化，性腺充分成熟；
[0063](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體30L，海水為經(jīng)紫外線照射45min的砂濾海水，親貝陰干3.5h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，每隔Imin間斷充氣lmin，7min后開始有親貝排放配子。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有300mL砂濾海水的燒杯內(nèi)，約6min后，配子基本排放完畢，獲得卵液15杯，精液5杯；
[0064](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子約280萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有2800mL海水的塑料燒杯；
[0065](4)鏡檢每杯精液，選擇精子游動(dòng)速度最快且分散良好的I杯精液，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，得到精液SOmL，備用；
[0066](5)取20mL精子，迅速加入卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-6個(gè)精子。繼續(xù)向盛有受精卵的燒杯中加入砂濾海水，至水體3000mL；
[0067](6)受精后13min，向受精卵中加入3mL CB溶液(CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為
0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中)，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，受精卵PBl未出現(xiàn)；
[0068](7)受精后19min，迅速將受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵18s，去除CB;受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度16粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率75.4% ；
[0069](8)利用步驟7中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為54.2%;
[0070](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度為24.8-250C，鹽度25，pH8.0，環(huán)境照度401ux。
[0071]實(shí)施例5
[0072](1)2012年6月初，在天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司育苗車間，利用在大神堂淺海采捕的2齡蛤仔作為親貝，親貝殼長40.2 ± 3.4mm，性腺自然發(fā)育成熟；
[0073](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體50L，海水為經(jīng)紫外線照射30min的砂濾海水，親貝陰干4h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，12min后開始有親貝排放配子，將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有500mL海水的燒杯內(nèi)，約1min后，配子基本排放完畢，獲得卵液8杯，精液7杯；
[0074](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子約180萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有ISOOmL海水的塑料燒杯；
[0075](4)鏡檢每杯精液，選擇精子游動(dòng)最快、分散均勻的一杯，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，備用；
[0076](5)取20mL精子，迅速加入(3)步所得卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-5個(gè)精子，向燒杯中加入砂濾海水至水體2000mL;
[0077](6)受精后15min，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，已有約20%的受精卵出現(xiàn)PBl;
[0078](7)受精后22min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵30s，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度20粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率65.7%；
[0079](8)利用步驟(7)中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為36.2%。
[0080](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度為25°C，鹽度30，pH 8.0，環(huán)境照度5001ux。
[0081 ] 實(shí)施例6
[0082](I )2013年6月中旬，在天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司育苗車間，利用在堿河口灘涂采捕的2-3齡蛤仔作為親貝，親貝殼長41.8 ± 2.6mm，性腺自然發(fā)育成熟；
[0083](2)催產(chǎn)桶內(nèi)水體40L，海水為經(jīng)紫外線照射60min的砂濾海水，親貝陰干3.5h后放入桶內(nèi)，間歇性充氣，Smin后開始有親貝排放配子，將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于盛有500mL海水的燒杯內(nèi)，約Smin后，配子基本排放完畢，獲得卵液12杯，精液7杯；
[0084](3)鏡檢每杯卵液，選擇卵子卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好的卵液2杯合并，得卵子約160萬枚，卵子懸浮液以ΙΟΟμπι孔徑的篩絹過濾去除組織碎片，以25μm孔徑篩絹清洗I次，收集卵子，置入已有ISOOmL海水的塑料燒杯；
[0085](4)鏡檢每杯精液，選擇精子游動(dòng)最快、分散均勻的一杯，迅速用25μπι篩絹濾除組織碎片，備用；
[0086](5)取12mL精子，迅速加入(3)步所得卵子懸浮液中，同時(shí)，迅速攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上3-6個(gè)精子，向燒杯中加入砂濾海水至水體2000mL ；
[0087](6)受精后lOmin，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液使藥物作用均勻，顯微鏡觀察，受精卵I3Bl未出現(xiàn)；
[0088](7)受精后19min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵20s，去除CB，受精卵重新懸浮于新鮮的砂濾海水中，孵化密度18粒/mL，24h后胚胎發(fā)育至D形幼蟲，孵化率僅為48.2%,大部分胚胎不能變態(tài)為D形幼蟲；
[0089](8)利用步驟(7)中獲得的初孵D形幼蟲作為樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測，四倍體誘導(dǎo)率為53.6%。
[0090](9)試驗(yàn)期間所用海水的溫度為27.8°C，鹽度26，pH 8.0，環(huán)境照度301ux。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:具體包括步驟如下: (1)選擇菲律賓蛤仔親貝，人工促熟或自然成熟； (2)親貝陰干4h，置入砂濾海水催產(chǎn)，將開始排放配子的親貝撿出，淡水沖洗10-30S，單個(gè)置于燒杯，繼續(xù)排放配子，排放完畢立即撿出親貝； (3)鏡檢每杯產(chǎn)物，選擇卵子發(fā)育良好、未被精子污染的卵液合并，卵液以ΙΟΟμπι篩絹過濾去除組織碎片，25μπι篩絹收集待用； (4)選擇活力良好的精子懸濁液，用25μπι篩絹濾除組織碎肩，收集下層液； (5)按精卵數(shù)量比3:1-6:1，將精子迅速加入卵子懸液，迅速攪動(dòng)卵液使之均勻受精，控制受精卵濃度在800-1000粒/mL; (6)受精后13min，向受精卵加入CB溶于二甲基亞砜配制的濃度為0.5mg/mL溶液，同時(shí)迅速攪動(dòng)卵液，維持受精卵保持懸浮狀態(tài)； (7)受精后19min，受精卵置于25μπι孔徑的篩絹內(nèi)，流水洗卵15_20s，去除CB; (8)受精卵重新懸浮于砂濾海水中進(jìn)行胚胎發(fā)育，培育密度15-20枚卵/ml; (9)受精后24h，胚胎發(fā)育至D形幼蟲階段，四倍體胚胎制備完成，用流式細(xì)胞術(shù)測定四倍體誘導(dǎo)率； (10)對(duì)上述步驟中所使用的砂濾海水進(jìn)行紫外線照射30-60min，控制砂濾海水溫度為24.8-25 0C，鹽度為24-26，pH值為8.0。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述親貝為2-3齡，殼面花紋清晰，殼長大于4cm的菲律賓蛤仔。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:整個(gè)試驗(yàn)期間，環(huán)境照度低于401ux。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述發(fā)育良好的卵子，指卵膜完整、規(guī)格一致、形狀呈規(guī)則球形、分散度良好;所述活力良好的精子指，鏡下檢查，分散度好、游動(dòng)迅速，多98%的精子具有正常活動(dòng)能力。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述CB的使用方法為，CB溶于二甲基亞砜配制的0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按體積比1:1000稀釋于受精卵懸液中。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于菲律賓蛤仔的四倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述胚胎發(fā)育，應(yīng)維持水體微充氣，每隔Ih攪動(dòng)水體至浮游期，胚胎保持懸浮狀態(tài)。
【文檔編號(hào)】A01K61/00GK105994058SQ201610382981
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】李永仁, 梁健, 郭永軍, 邢克智
【申請(qǐng)人】天津農(nóng)學(xué)院