一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]奇異南星(Arisaema decipiens)又稱鐵燈臺、青腳蓮,是天南星科(Araceae)天南星屬(Arisaema)植物,分布在印度以及中國大陸的廣西、云南等地,生長于海拔880米至3400米的地區(qū)，多生在山坡灌叢中，目前尚未由人工引種栽培。該植物根莖入藥，主治無名腫毒、乳腺炎、癰疽、毒蛇咬傷、蜂蝎螫傷、蜘蛛及老鼠咬傷。在侗族聚居地，當地人通過外用奇異南星的塊莖來治療乳腺癌。目前，對于奇異南星的研究很少，僅見一篇有關于其化學成分的報道，對其組織培養(yǎng)的研究尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的一個目的是提供一種奇異南星離體培養(yǎng)的方法。
[0004]本發(fā)明所提供的奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟:將奇異南星的組培無菌苗的葉柄進行切段，得到葉柄段；將葉柄段進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。
[0005]上述方法中，所述愈傷組織誘導培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L,2，4-D在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L ；
[0006]上述方法中，所述愈傷組織誘導培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為12h.d \ 光照強度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0007]上述方法中，所述葉柄段的長度為0.5cm。
[0008]上述方法中，所述“再將愈傷組織進行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗”包括如下步驟:將所述愈傷組織進行不定芽誘導培養(yǎng)，得到帶有不定芽和不定根的幼苗。
[0009]上述方法中，所述不定芽誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L，具體為0.5mg/L 或 2.0mg/L ；
[0010]上述方法中，所述不定芽誘導培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為12h.d \ 光照強度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0011]上述方法中，在所述進行不定芽誘導培養(yǎng)之前，還包括對所述愈傷組織進行繼代培養(yǎng)的步驟。
[0012]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和24-D，使6-BA在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L, 2，4-D在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為 0.5mg/L、1.0mg/L 或 4.0mg/L ；
[0013]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為I?!.Cf1、光照強度為 30 ?40mmol.m 2.s、
[0014]上述方法中，所述奇異南星的組培無菌苗按照如下方法制備得到:將奇異南星的種子用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)溫度為23?27 V ’光照強度為30?40mmol.πΓ2.s-1,培養(yǎng)30天,得到所述無菌苗。
[0015]本發(fā)明的另一個目的是提供奇異南星離體培養(yǎng)中使用的愈傷組織誘導培養(yǎng)基和/或不定芽誘導培養(yǎng)基。
[0016]上述奇異南星愈傷組織誘導培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2，4_D在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L。
[0017]上述奇異南星不定芽誘導培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L ο
[0018]實驗證明，利用本發(fā)明奇異南星離體培養(yǎng)方法能夠成功獲得奇異南星再生苗，該方法對有效保護和利用野生奇異南星資源有重要意義。
【具體實施方式】
[0019]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021]實施例1、奇異南星離體繁殖方法
[0022]一、植物材料來源及消毒處理
[0023]奇異南星種子采于廣西省靖西縣龍邦鎮(zhèn)。將采集的種子用自來水沖洗lh，再用蒸餾水浸泡24h后，于超凈工作臺內先用體積分數為75%乙醇表面消毒30s，再用質量分數為
0.1 %升萊消毒7min，最后用無菌水沖洗5次。
[0024]二、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
[0025]以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基經121°C高壓滅菌20min。以消毒后種子作為外植體，接種后，每天光照12h，置于溫度為25±2°C，光照強度為30?40mmol.πΓ2.s—1的培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。
[0026]三、無菌苗的獲得
[0027]大約I周左右，接種于MS培養(yǎng)基的消毒后種子開始萌發(fā)，15d后長出葉片，30d后苗高3?5cm，得到無菌苗。
[0028]四、愈傷組織的誘導與增殖
[0029]在超凈工作臺內，將奇異南星無菌苗的葉片切成約0.5X0.5cm大小的切塊，將葉柄切成0.5cm長的切段，分別接種到含有不同濃度的2，4-D和6-BA的培養(yǎng)基中進行愈傷組織的誘導。愈傷組織誘導的培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0mg/L+2, 4-D 1.0mg/L。將愈傷組織置于溫度為25±2°C、光照時間為12h.Cf1和光照強度為30?40mmol.πΓ2.s—1的培養(yǎng)條件下進行誘導。葉柄2周后可誘導出愈傷組織，而葉片褐化死亡，不能誘導出愈傷組織。
[0030]將誘導出的愈傷組織接種于MS+6-BA(0.5?4.0)mg/L+2, 4-D (0.5?4.0)mg/L培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度為25±2°C、光照時間為12h.(!'光照強度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0031]愈傷組織迅速增殖，增殖倍數為8.09?11.72倍。當6_BA和2，4_D的濃度均為
0.5mg/L時，愈傷組織增殖倍數為9.34，當6-BA和2，4-D的濃度均為4.0mg/L時，愈傷組織增殖倍數為8.09。其中MS+6-BA1.0mg/L+2, 4-D 1.0mg/L培養(yǎng)基的增殖效果最好，愈傷組織增殖倍數達11.72倍。
[0032]五、不定芽的誘導及植株再生
[0033]在添加IAA和6-BA的培養(yǎng)基中誘導不定芽，不定芽誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基:MS+IAA(0.5?2.0)mg/L+6-BA(0.5?2.0)mg/L。將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織置于溫度為25±2°C、光照時間為12h.(Γ1、光照強度為30?40mmol.m_2.s—1的培養(yǎng)條件下進行不定芽誘導。
[0034]不定芽的誘導率與兩種生長調節(jié)劑的濃度密切相關，當IAA和6-BA的濃度均為
0.5mg/L時，不定芽的誘導率最高，可達82%，并且不定芽的生長狀況良好，葉柄較粗，葉片較大，生長旺盛。當IAA和6-BA的濃度均為2.0mg/L時，不定芽的誘導率為42.67%。
[0035]在誘導不定芽的同時，不定芽開始出現白色不定根，隨后根尖伸長，不定根呈輻射狀分布，大多數根較粗壯，根毛較多，生根率達到100%，平均生根條數為10.35條，平均根長為 7.43cm。
[0036]六、煉苗與移栽
[0037]將三角瓶的瓶口打開進行煉苗。I周后，將長勢良好、根系發(fā)達的再生苗取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至由泥炭土、珍珠巖和沙(4:3:2，v/v/v)組成的混合基質中，置于相對濕度為80%?90%、溫度為20°C左右的環(huán)境中培養(yǎng)，定時澆水，30d后成活率達100%。
【主權項】
1.一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟:將奇異南星的組培無菌苗的葉柄進行切段，得到葉柄段；將葉柄段進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述愈傷組織誘導培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2, 4-D在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L ； 所述愈傷組織誘導培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為12h.Cf1、光照強度為30 ?40mmol.m 2.s、
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葉柄段的長度為0.5cm。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述“再將愈傷組織進行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗”包括如下步驟:將所述愈傷組織進行不定芽誘導培養(yǎng)，得到帶有不定芽和不定根的幼苗。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述不定芽誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L，具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L ； 所述不定芽誘導培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為12h.(Γ1、光照強度為30 ?40mmol.m 2.s、
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在所述進行不定芽誘導培養(yǎng)之前，還包括對所述愈傷組織進行繼代培養(yǎng)的步驟。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L, 2，4-D在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L ； 所述繼代培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時間為12h.Cf1、光照強度為30?40mmo1.πΓ2.s-1。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述奇異南星的組培無菌苗按照如下方法制備得到:將奇異南星的種子用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)溫度為23?27°C，光照強度為30?40mmol.πΓ2.s4,培養(yǎng)30天,得到所述無菌苗。
9.奇異南星愈傷組織誘導培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2，4-D在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/Lο
10.奇異南星不定芽誘導培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L,6-BA在所述不定芽誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/Lο
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟：將奇異南星的組培無菌苗的葉柄進行切段，得到葉柄段；將葉柄段進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。實驗證明，利用本發(fā)明奇異南星離體培養(yǎng)方法能夠成功獲得奇異南星再生苗，該方法對有效保護和利用野生奇異南星資源有重要意義。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104642106
【申請?zhí)枴緾N201410263736
【發(fā)明人】王俊麗, 張璐, 李曉旭, 馬林喜, 費良丹, 田璧瑞, 郭萌, 彭耀
【申請人】中央民族大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年6月13日