本發(fā)明屬于細(xì)胞凍存液，具體涉及一種細(xì)胞凍存液及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，我們在生物技術(shù)學(xué)及其相關(guān)科學(xué)的研究中，越來越多的運(yùn)用組織細(xì)胞培養(yǎng)繁殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的組織細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長期的保存，一旦有需要，可以隨時對所有的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征，供生命科學(xué)研究使用，細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇，是直接影響細(xì)胞增殖成功與否的關(guān)鍵技術(shù)。

2、細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存時必須的一種溶液，凍存液的作用是，使細(xì)胞均勻的分散在溶液中，給細(xì)胞一個均勻分布的環(huán)境和空間，同時供給細(xì)胞生命代謝所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，防止或減少冷凍冰晶對細(xì)胞的損傷作用。

3、長期以來，大量國內(nèi)外生物細(xì)胞學(xué)術(shù)相關(guān)書籍，介紹的常規(guī)凍存液配方和我們長期所使用的凍存液配方均為：細(xì)胞培養(yǎng)液70-80％，牛血清10-20％，二甲基亞砜10％。常規(guī)使用的培養(yǎng)液mem，dmem，hyclone，cd293，hipp-t009等均已市場商品化。

4、使用現(xiàn)有的上述常規(guī)凍存液，凍存細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后12小時，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，存活率一般在60％左右，當(dāng)存活率小于60％時，細(xì)胞生長繁殖緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞比較細(xì)小，長勢比較差，基本上不能存活。當(dāng)細(xì)胞存活率在60％以上時，細(xì)胞分布比較均勻，活細(xì)胞比較多，形態(tài)比較正常，長滿單層需要6-8天。

5、經(jīng)過大量的實(shí)際生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)得出，采用現(xiàn)有這種凍存液凍存的細(xì)胞，在復(fù)蘇后存活率一般在50-70％，成活率比較低，細(xì)胞貼壁率為30-50％。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種細(xì)胞凍存液及應(yīng)用，達(dá)到提高凍存細(xì)胞存活率的目的，保證細(xì)胞生長的質(zhì)量和縮短細(xì)胞增殖的時間。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)胞凍存液，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液5-30％、小牛血清45-70％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％的碳酸氫鈉3％和配制溶液r10％。

4、進(jìn)一步的，配制溶液r由如下部分組成：110-140mg/ml的d-葡萄糖、90-120mg/ml羥乙基淀粉、70-100mg/ml乳糖酸，30-60mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、30-60mg/ml五水d-棉子糖、11-14mg/ml氫氧化鉀、7-10mg/ml磷酸二氫鉀、2-5mg/ml七水硫酸鎂、2-5mg/ml腺苷、60-90μmol/l的維生素c和15-45μmol/l的維生素e。

5、進(jìn)一步的，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液5％、小牛血清70％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為110mg/ml的d-葡萄糖、90mg/ml羥乙基淀粉、70mg/ml乳糖酸，30mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、30mg/ml五水d-棉子糖、11mg/ml氫氧化鉀、7mg/ml磷酸二氫鉀、2mg/ml七水硫酸鎂、2mg/ml腺苷、60μmol/l的維生素c和15μmol/l的維生素e。

6、進(jìn)一步的，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液10％、小牛血清65％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為120mg/ml的d-葡萄糖、100mg/ml羥乙基淀粉、80mg/ml乳糖酸、40mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、40mg/ml五水d-棉子糖、12mg/ml氫氧化鉀、8mg/ml磷酸二氫鉀、3mg/ml七水硫酸鎂、3mg/ml腺苷、70μmol/l的維生素c和25μmol/l的維生素e。

7、進(jìn)一步的，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液20％、小牛血清55％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為130mg/ml的d-葡萄糖、110mg/ml羥乙基淀粉、90mg/ml乳糖酸、50mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、50mg/ml五水d-棉子糖、13mg/ml氫氧化鉀、9mg/ml磷酸二氫鉀、4mg/ml七水硫酸鎂、4mg/ml腺苷、80μmol/l的維生素c和35μmol/l的維生素e。

8、進(jìn)一步的，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液30％、小牛血清45％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為140mg/ml的d-葡萄糖、120mg/ml羥乙基淀粉、100mg/ml乳糖酸、60mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、60mg/ml五水d-棉子糖、14mg/ml氫氧化鉀、10mg/ml磷酸二氫鉀、5mg/ml七水硫酸鎂、5mg/ml腺苷、90μmol/l的維生素c和45μmol/l的維生素e。

9、一種細(xì)胞凍存液在肝細(xì)胞凍存中的應(yīng)用，肝細(xì)胞凍存過程：培養(yǎng)生長成單層的hl2，tg2，tg3，tgc4細(xì)胞，各1瓶→加入ph7.0的pbs洗細(xì)胞表面一次→0.25％的胰酶消化2min→棄掉胰酶→加入培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液→離心1000rpm/5min→棄上清→分別加入改進(jìn)后的凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度(1±0.2)×107個活細(xì)胞/ml→分裝1ml/管→放入程序降溫盒→-80℃過夜→浸入液氮中長期保存。

10、一種細(xì)胞凍存液在肝細(xì)胞復(fù)蘇中的應(yīng)用，肝細(xì)胞的復(fù)蘇過程：從液氮中取出用各組分凍存液凍存的hl2，tg2，tg3，tgc4細(xì)胞，各1支→置入37℃水浴溶解→離心1000rpm/3min→棄掉上清→加入20％小牛血清培養(yǎng)液10ml→置37℃培養(yǎng)。

11、本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)液可以任意選用以下一種：mem、dmem、hyclone、cd293、hipp-t009。

12、本發(fā)明的凍存液應(yīng)用在肝細(xì)胞凍存和復(fù)蘇中，采用了細(xì)胞培養(yǎng)液，小牛血清，二甲基亞砜，谷氨酰胺，碳酸氫鈉，配制溶液r。其中配制溶液r由如下部分組成：d-葡萄糖、羥乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水d-棉子糖、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、腺苷、維生素c、維生素e。均按一定的比例配制。能提高凍存細(xì)胞的存活率，可達(dá)90％以上，細(xì)胞貼壁率能達(dá)到80％以上，保證了細(xì)胞生長的質(zhì)量，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期，節(jié)約了時間成本。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于：

14、本發(fā)明改進(jìn)后的細(xì)胞凍存液，細(xì)胞存活率能達(dá)到90％以上，細(xì)胞貼壁率能達(dá)到80％以上，比常規(guī)的存活率有顯著的提高，保證了細(xì)胞生長的質(zhì)量和生物學(xué)特性，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期，使復(fù)蘇后的細(xì)胞能及時，保質(zhì)保量的提供給生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)使用。

15、上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述內(nèi)容和其目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液5-30％、小牛血清45-70％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％的碳酸氫鈉3％和配制溶液r10％。

2.如權(quán)利要求1所述一種細(xì)胞凍存液，其特征在于：配制溶液r由如下部分組成：110-140mg/ml的d-葡萄糖、90-120mg/ml羥乙基淀粉、70-100mg/ml乳糖酸，30-60mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、30-60mg/ml五水d-棉子糖、11-14mg/ml氫氧化鉀、7-10mg/ml磷酸二氫鉀、2-5mg/ml七水硫酸鎂、2-5mg/ml腺苷、60-90μmol/l的維生素c和15-45μmol/l的維生素e。

3.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞凍存液，其特征在于：包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液5％、小牛血清70％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為110mg/ml的d-葡萄糖、90mg/ml羥乙基淀粉、70mg/ml乳糖酸，30mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、30mg/ml五水d-棉子糖、11mg/ml氫氧化鉀、7mg/ml磷酸二氫鉀、2mg/ml七水硫酸鎂、2mg/ml腺苷、60μmol/l的維生素c和15μmol/l的維生素e。

4.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞凍存液，其特征在于：包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液10％、小牛血清65％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為120mg/ml的d-葡萄糖、100mg/ml羥乙基淀粉、80mg/ml乳糖酸、40mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、40mg/ml五水d-棉子糖、12mg/ml氫氧化鉀、8mg/ml磷酸二氫鉀、3mg/ml七水硫酸鎂、3mg/ml腺苷、70μmol/l的維生素c和25μmol/l的維生素e。

5.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞凍存液，其特征在于：包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液20％、小牛血清55％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為130mg/ml的d-葡萄糖、110mg/ml羥乙基淀粉、90mg/ml乳糖酸、50mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、50mg/ml五水d-棉子糖、13mg/ml氫氧化鉀、9mg/ml磷酸二氫鉀、4mg/ml七水硫酸鎂、4mg/ml腺苷、80μmol/l的維生素c和35μmol/l的維生素e。

6.如權(quán)利要求2所述一種細(xì)胞凍存液，其特征在于：包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液30％、小牛血清45％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％碳酸氫鈉3％和10％的配制溶液r；配制溶液r組分為140mg/ml的d-葡萄糖、120mg/ml羥乙基淀粉、100mg/ml乳糖酸、60mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、60mg/ml五水d-棉子糖、14mg/ml氫氧化鉀、10mg/ml磷酸二氫鉀、5mg/ml七水硫酸鎂、5mg/ml腺苷、90μmol/l的維生素c和45μmol/l的維生素e。

7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述一種細(xì)胞凍存液在肝細(xì)胞凍存中的應(yīng)用，其特征在于：肝細(xì)胞凍存過程：培養(yǎng)生長成單層的肝細(xì)胞→加入ph7.0的pbs洗細(xì)胞表面一次→0.25％的胰酶消化2min→棄掉胰酶→加入培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液→離心1000rpm/5min→棄上清→加入細(xì)胞凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度(1±0.2)×107個活細(xì)胞/ml→分裝1ml/管→放入程序降溫盒→-80℃過夜→浸入液氮中長期保存。

8.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述一種細(xì)胞凍存液在肝細(xì)胞復(fù)蘇中的應(yīng)用，其特征在于：肝細(xì)胞的復(fù)蘇過程：從液氮中取出用凍存液凍存的肝細(xì)胞→置入37℃水浴溶解→離心1000rpm/3min→棄掉上清→加入20％小牛血清培養(yǎng)液10ml→置37℃培養(yǎng)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于細(xì)胞凍存液技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞凍存液及應(yīng)用，細(xì)胞凍存液，包括以下體積百分比的原料：細(xì)胞培養(yǎng)液5?30％、小牛血清45?70％、二甲基亞砜10％、3％的谷氨酰胺2％、7.5％的碳酸氫鈉3％和配制溶液R10％，凍存液應(yīng)用在肝細(xì)胞凍存和復(fù)蘇中，本發(fā)明改進(jìn)后的細(xì)胞凍存液，細(xì)胞存活率能達(dá)到90％以上，細(xì)胞貼壁率能達(dá)到80％以上，比常規(guī)的存活率有顯著的提高，保證了細(xì)胞生長的質(zhì)量和生物學(xué)特性，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期，使復(fù)蘇后的細(xì)胞能及時，保質(zhì)保量的提供給生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)使用。

技術(shù)研發(fā)人員：林登宇,張小敏,郭偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶仝干醫(yī)療科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9