豬冷凍精液稀釋液的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬冷凍精液稀釋液的制備方法。包括４種稀釋液組分及配制步驟如下：液A：葡萄糖、檸檬酸鈉、氯化鈉、青霉素；液B：乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素、鮮蛋黃：液C：葡萄糖、檸檬酸鈉、氯化鈉、青霉素、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水；液D：無(wú)水檸檬酸、咖啡因g、三羥甲基氨基甲烷、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖；將各原料分別溶于100ml雙餾水，制成四種稀釋液，調(diào)pH值至6.5～7.5，置冰箱中冷藏。本發(fā)明的產(chǎn)品用于豬精液稀釋液的冷凍保存。
【專利說(shuō)明】豬冷凍精液稀釋液的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種豬冷凍精液稀釋液的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，一些優(yōu)秀種公畜的精液通過(guò)相關(guān)技術(shù)的處理制成冷凍精液，并通過(guò)人工授精技術(shù)大力推廣使用。其中豬冷凍精液與人工授精技術(shù)的結(jié)合在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中有非常廣闊的市場(chǎng)前景，可以不受該公豬死亡、采精間隔、繁殖不育的限制；不受時(shí)間和地理位置差異的限制，并且可以大量減少公畜的飼養(yǎng)數(shù)量，降低飼養(yǎng)成本、使優(yōu)質(zhì)基因遺傳概率達(dá)到最大化，為養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測(cè)提供了足夠的時(shí)間，凍精還為大型的人工授精站爆發(fā)疾病時(shí)提供了穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障?？傊?，豬精液冷凍技術(shù)的發(fā)展和冷凍精液的使用在品種引進(jìn)、雜交改良、以及提高繁殖性能、疾病控制及遺傳多樣性保護(hù)方面具有重要意義。
[0003]稀釋液是豬、牛、羊等精液冷凍時(shí)必不可少的組成成分，在冷凍過(guò)程中對(duì)精子起到稀釋、緩沖、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)的作用，并有效降低低溫對(duì)精子的影響。
[0004]精液冷凍是保存遺傳資源，建立精子基因庫(kù)的重要措施。而冷凍后精子質(zhì)量的好壞與家畜的妊娠率，產(chǎn)子率等密切相關(guān)。目前為止，豬精子在冷凍以后的精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率等不很理想，致使在商品化養(yǎng)豬生產(chǎn)中，利用冷凍精液進(jìn)行人工授精的母豬受胎率和產(chǎn)仔率較低而不能廣泛應(yīng)用，嚴(yán)重降低了優(yōu)質(zhì)公豬的利用率，飼養(yǎng)成本不能降低，生態(tài)環(huán)境的污染更沒(méi)有得到緩解。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷問(wèn)題，提供一種豬凍精液稀釋液的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
包括稀釋液A、稀釋液B、稀釋液C和稀釋液D ；四種稀釋液各原料的質(zhì)量配比及配制步驟如下:
稀釋液A:葡萄糖3.5?5.0g、檸檬酸鈉0.18?0.30g、氯化鈉0.1?0.23g、青霉素0.2 ?0.45g ；
將上述原料溶于10ml雙蒸水中，調(diào)pH值至6.5?7.5，放在一旁降至室溫，移至冰箱中冷減備用；
稀釋液B:乳糖5.00?12.5g、葡萄糖2?5.lg、青霉素80萬(wàn)u?100萬(wàn)U、鏈霉素0.20g ?0.5g，鮮蛋黃:25 ?33ml ；
將稱取的上述原料溶于10ml雙餾水，制成稀釋液B ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用；
稀釋液C:乳糖5.00?12.5g、葡萄糖2?5.lg、青霉素80萬(wàn)u?100萬(wàn)U、鏈霉素0.20g?0.5g,鮮蛋黃25?33ml,甘油6.7?9.5g,挪油單乙醇酸胺0.44?0.50g,十二烷基硫酸鈉0.10?0.16g,三乙醇胺0.025?0.050g,鹽酸0.01?0.035g,蒸餾水0.4?1.2g；
將稱取的上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素溶于10ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液；然后加入鮮蛋黃、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水，攪拌均勻；降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用；
稀釋液D:無(wú)水檸檬酸0.3?0.89g、咖啡因0.025?0.045g、三羥甲基氨基甲烷0.45?0.90g、碳酸氫鈉0.30?0.85g、乙二胺四乙酸二鈉0.18?0.43g、丙酮酸鈉0.0085 ?0.042g、葡萄糖 2.5 ?4.3g ;
將稱取的上述原料溶于10ml雙蒸水制成稀釋液D ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0007]進(jìn)一步，所述的四種稀釋液所用的雙蒸水的溫度均為32_38°C。
[0008]1、本發(fā)明設(shè)計(jì)的機(jī)理為:由于豬的精子較他家畜精子脂肪含量高，在降溫和冷凍處理過(guò)程中不易存活這一特性，所以我們研發(fā)了豬的冷凍精液專項(xiàng)配方和獨(dú)特的操作流程;
2、專項(xiàng)的稀釋液配方:使精子在不同的降溫處理階段給予優(yōu)勢(shì)條件，使其不斷地得到加能，不但有利于精子在解凍時(shí)順利復(fù)蘇，還有利于精子在冷凍的過(guò)程中抵抗冷沖擊，保持精子細(xì)胞的完整。在稀釋液D中復(fù)蘇的精子會(huì)得到再次加能，最終使經(jīng)過(guò)冷凍的精子的運(yùn)動(dòng)速度、存活時(shí)間、受精能力都強(qiáng)于常溫精液中精子的水平。
[0009]3、精液采集與獨(dú)特的降溫處理方式:精液采集后會(huì)采用特制流程對(duì)精子代謝物和精清中一些有害物質(zhì)進(jìn)行除雜，再次加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為進(jìn)行下一階段的降溫處理提供能源，并在冷凍之前給予抗冷凍物質(zhì)，準(zhǔn)確控制精子與抗冷凍成分接觸時(shí)間，既能降低甘油對(duì)精子的損害同時(shí)還起到冷凍保護(hù)作用。
[0010]完成以上發(fā)明機(jī)理包括以下成分及作用:
乳糖和葡萄糖配合使用作為主要的能源物質(zhì)；檸檬酸鈉具有良好的pH調(diào)節(jié)及緩沖性能。氯化鈉是主要是控制精子細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)平衡；檸檬酸和三羥甲基氨基甲烷相互配合主要作為緩沖溶液使用，乙二胺四乙酸二鈉有保護(hù)精子抗冷休克的作用，又可通過(guò)改變細(xì)胞膜滲透性，降低精子活動(dòng)，從而延長(zhǎng)精子壽命并保持受精能力。丙酮酸鈉在此配方中主要起到強(qiáng)力的抗氧化作用，提高精子在缺氧情況的耐受能力，它全身堿化作用使其無(wú)論在缺氧或是有氧條件下都能消耗【H+】，保護(hù)精子細(xì)胞的基本功能。同時(shí)碳酸氫鈉在維持滲透壓也起著很重要的作用，精子在體內(nèi)處在等滲的精清中，如果精清部分的鹽濃度較高，則滲透壓高，精子易脫水；反之，滲透壓低，易使精子膨脹。適量使用碳酸氫鈉可有效維持豬精液稀釋液的滲透壓。
[0011]咖啡因好似一種環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的抑制劑，當(dāng)其作用于精子時(shí)，使精子內(nèi)鈣離子內(nèi)流和活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的激活，導(dǎo)致胞內(nèi)CAMP濃度的升高，從而誘發(fā)和維持精子的活力，促進(jìn)精子獲能，同時(shí)咖啡因還增強(qiáng)精子糖酵解的能力，從而增進(jìn)其頂體反應(yīng)能力，這對(duì)輔助生育中弱精改善有一定的幫助。同時(shí)咖啡因還增強(qiáng)精子糖酵解的能力，從而增進(jìn)其頂體反應(yīng)能力。
[0012]青霉素和鏈霉素主要起到殺菌，抑制微生物生長(zhǎng)作用。
[0013]因?yàn)榕浞街泻絮r蛋黃，其中的油脂不易溶解，再加上其他一些成分中會(huì)存在一些微小粒子，如果不使其充分溶解，會(huì)影響該成分在配方中作用的發(fā)揮和一些微小粒子會(huì)不利于精子正常運(yùn)動(dòng)，因此，我們?cè)谂浞街刑砑右韵鲁煞?椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺:將它們配合使用，起到水份與油脂充分溶解的作用，微量的鹽酸主要用于PH的調(diào)節(jié)，以此保證稀釋液的PH值的穩(wěn)定性。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用上述配方進(jìn)行豬精液稀釋液的冷凍保存，可獲得良好的效果，解凍后精子活力達(dá)78%以上，頂體完整率達(dá)78%以上、質(zhì)膜完整率(PI染色)23%以下，線粒體活性(Rh123染色)達(dá)71%以上，畸形率12%以下。
[0015]【具體實(shí)施方式】:
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0016]實(shí)施例1 稀釋液A配制:
稱取葡萄糖5.0g、檸檬酸鈉0.18g、氯化鈉0.23g、青霉素0.2g。將上述原料溶于溶于38°C的10ml雙蒸水中，用酸或堿調(diào)pH值至6.5?7.5，放在一旁降至室溫，移至冰箱中冷藏備用。
[0017]稀釋液B配制:
稱取乳糖5.00g、葡萄糖5.lg、青霉素100萬(wàn)U、鏈霉素0.20g,鮮蛋黃:33ml,雙蒸水10ml ;將上述原料溶于溶于38°C的10ml雙餾水，制成稀釋液B ;降至室溫，用酸或堿調(diào)pH值至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0018]稀釋液C配制:
稱取乳糖5.00g、葡萄糖5.lg、青霉素80萬(wàn)U、鏈霉素0.5g,鮮蛋黃25，甘油6.7g,椰油單乙醇酰胺0.50g，十二烷基硫酸鈉0.10g，三乙醇胺0.025g，鹽酸0.035g，蒸餾水0.4g,雙蒸水100ml。將上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素溶于38°C的100ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液；然后加入鮮蛋黃、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水，攪拌均勻；降至室溫，調(diào)PH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0019]稀釋液D配制:
稱取無(wú)水檸檬酸0.89g、咖啡因0.025g、三羥甲基氨基甲烷0.45g、碳酸氫鈉0.85g、乙二胺四乙酸二鈉0.18g、丙酮酸鈉0.0085g、葡萄糖4.3g，雙蒸水10ml ;稱取的各原料溶于38°C的10ml雙蒸水制成稀釋液D ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0020]實(shí)施例2
稀釋液A配制:
稱取葡萄糖3.58、檸檬酸鈉0.3 08、氯化鈉().18、青霉素0.4 5 g。將上述原料溶于溶于3 2 °C的10ml雙蒸水中，用酸或堿調(diào)pH值至6.5?7.5，放在一旁降至室溫，移至冰箱中冷藏備用。
[0021]稱取乳糖I 2.5 0g、葡萄糖2.0 g、青霉素80萬(wàn)U、鏈霉素0.5(^，鮮蛋黃:2 5 ml，雙蒸水10ml ;將上述原料溶于溶于3 2 °C的10ml雙餾水，制成稀釋液B ;降至室溫，用酸或堿調(diào)PH值至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0022]稀釋液C配制:
稱取乳糖I 2.50g、葡萄糖2.0g、青霉素I 00萬(wàn)U、鏈霉素0.2g，鮮蛋黃3 3g，甘油9.5 g,椰油單乙醇酰胺0.4 4 g,十二燒基硫酸鈉0.1Og,三乙醇胺0.05 Og,鹽酸0.0 I g,蒸餾水1.2 g，雙蒸水100ml。將上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素溶于32 °〇的10ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液；然后加入鮮蛋黃、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水，攪拌均勻；降至室溫，調(diào)PH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0023]稀釋液D配制:
稱取無(wú)水朽1檬酸0.3 g、咖啡因0.4 5g、三輕甲基氨基甲燒0.90g、碳酸氫鈉0.30g、乙二胺四乙酸二鈉0.43g、丙酮酸鈉0.042g、葡萄糖2.5g，雙蒸水10ml ;稱取的各原料溶于32°C的10ml雙蒸水制成稀釋液D ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0024]實(shí)施例3
稀釋液A配制:
稱取葡萄糖4.5 g、檸檬酸鈉0.25g、氯化鈉0.15g、青霉素0.3g。將上述原料溶于溶于35°C的10ml雙蒸水中，用酸或堿調(diào)pH值至6.5?7.5，放在一旁降至室溫，移至冰箱中冷藏備用。
[0025]稀釋液B配制:
稱取乳糖8.00g、葡萄糖3.5g、青霉素90萬(wàn)U、鏈霉素0.35g,鮮蛋黃30ml,雙蒸水10ml ;將上述原料溶于溶于35°C的10ml雙餾水，制成稀釋液B ;降至室溫，用酸或堿調(diào)pH值至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0026]稀釋液C配制:
稱取乳糖9.0g、葡萄糖3.5g、青霉素90萬(wàn)U、鏈霉素0.35g,鮮蛋黃3 Og,甘油8.0g,椰油單乙醇酰胺0.4 8g,十二燒基硫酸鈉0.13g,三乙醇胺0.035g,鹽酸0.025g,蒸懼水0.Sg,雙蒸水100ml。將上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素溶于35°C的10ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液；然后加入鮮蛋黃、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水，攪拌均勻；降至室溫，調(diào)PH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0027]稀釋液D配制:
稱取無(wú)水朽1檬酸0.6g、咖啡因0.35g、三輕甲基氨基甲燒0.70g、碳酸氫鈉0.60g、乙二胺四乙酸二鈉0.30g、丙酮酸鈉0.002g、葡萄糖3.5g，雙蒸水10ml ;稱取的各原料溶于35°C的10ml雙蒸水制成稀釋液D ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
[0028]豬精液冷凍保存應(yīng)用試驗(yàn):
(一) 精液采集
由專業(yè)人員進(jìn)行精液采集(制作冷凍精液所采用的公豬均為參加省級(jí)以上生產(chǎn)性能測(cè)定，且成績(jī)優(yōu)秀的豬。以此達(dá)到我們研發(fā)豬冷凍精液的目的之一:使優(yōu)質(zhì)基因遺傳概率最大化)用顯微鏡在37°C下進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢測(cè)，選擇精液的品質(zhì)應(yīng)該是無(wú)異味，呈乳白色，精子密度大、活力不低于90%，畸形精子率小于6%。
[0029]( 二)精液的處理
將等溫的稀釋液A緩慢加入到新鮮精液中(按比例1:1-1.5稀釋)，降溫至17度，離心處理10分鐘，離心力:800G ;棄去上清液，根據(jù)最終所需精液濃度0.5ml精液中含精子為2億，兌上稀釋液B，將兌好的精液降溫至4°C -5°C，加入稀釋液C，平衡半小時(shí)，灌裝冷凍。
[0030](三)精液冷凍
迅速將灌裝后的凍精細(xì)管移到液氮池中，冷凍5-11分鐘，然后將精液細(xì)管迅速投入液氮里進(jìn)行保存。
[0031](四)精液解凍
解凍鏡檢的方法是將保存在液氮里面的凍精細(xì)管投入到50°C的水中進(jìn)行解凍，保持10-13秒，迅速?gòu)乃腥〕鼍杭?xì)管，用紙巾將精液細(xì)管表面的水分擦拭干凈，用精液剪將細(xì)管的兩端剪開(kāi)，使精液流進(jìn)D液中進(jìn)行稀釋。
[0032](五)精液評(píng)定
解凍后精子活力達(dá)78%以上，頂體完整率達(dá)78%以上，質(zhì)膜完整率(PI染色)23%以下，線粒體活性(Rh123染色)達(dá)71%以上，畸形率12%以下。
[0033]解凍后的精子17°C恒溫條件下存活時(shí)間能達(dá)84小時(shí)，38°C恒溫條件下存活時(shí)間能達(dá)5-6小時(shí)，室溫下(25°C -27°C )存活時(shí)間不低于60小時(shí)。冷凍精液的運(yùn)動(dòng)速度、存活時(shí)間和受精能力都顯著高于常溫精液。
[0034](四)凍精應(yīng)用
(五)將冷凍精液應(yīng)用到配種實(shí)驗(yàn)中，選擇300頭發(fā)情正常且無(wú)生產(chǎn)疾病的母豬進(jìn)行凍精配種實(shí)驗(yàn)(其中初產(chǎn)母豬100頭和經(jīng)產(chǎn)母豬200頭)，初產(chǎn)母豬準(zhǔn)胎率為86%，經(jīng)產(chǎn)母豬準(zhǔn)胎率達(dá)90%。
[0035](六)最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種豬冷凍精液稀釋液的制備方法，其特征在于:包括稀釋液A、 稀釋液B、稀釋液C和稀釋液D ;四種稀釋液各原料的質(zhì)量配比及配制步驟如下: 稀釋液A:葡萄糖3.5?5.0g、檸檬酸鈉0.18?0.30g、氯化鈉0.1?0.23g、青霉素0.2 ?0.45g ； 將上述原料溶于10ml雙蒸水中，調(diào)pH值至6.5?7.5，放在一旁降至室溫，移至冰箱中冷減備用； 稀釋液B:乳糖5.00?12.5g、葡萄糖2?5.lg、青霉素80萬(wàn)u?100萬(wàn)U、鏈霉素0.20g ?0.5g，鮮蛋黃:25 ?33ml ； 將稱取的上述原料溶于10ml雙餾水，制成稀釋液B ;降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用； 稀釋液C:乳糖5.00?12.5g、葡萄糖2?5.lg、青霉素80萬(wàn)u?100萬(wàn)U、鏈霉素0.20g?0.5g,鮮蛋黃25?33ml,甘油6.7?9.5g,挪油單乙醇酸胺0.44?0.50g,十二烷基硫酸鈉0.10?0.16g,三乙醇胺0.025?0.050g,鹽酸0.01?0.035g,蒸餾水0.4?1.2g； 將稱取的上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、鏈霉素溶于10ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液；然后相應(yīng)加入鮮蛋黃、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水，攪拌均勻；降至室溫，調(diào)PH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用； 稀釋液D:無(wú)水檸檬酸0.3?0.89g、咖啡因0.025?0.045g、三羥甲基氨基甲烷0.45?0.90g、碳酸氫鈉0.30?0.85g、乙二胺四乙酸二鈉0.18?0.43g、丙酮酸鈉0.0085 ?0.042g、葡萄糖 2.5 ?4.3g ; 將稱取的上述原料溶于10ml雙蒸水制成稀釋液D ；降至室溫，調(diào)pH值穩(wěn)定至6.5?7.5，移至冰箱中冷藏備用。
2.如權(quán)利要求1所述的一種豬冷凍精液稀釋液的制備方法，其特征在于:所述的四種稀釋液所用的雙蒸水的溫度均為32-38°C。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK104381247SQ201410716190
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】周學(xué)軍 申請(qǐng)人:三河市盛繁商貿(mào)有限公司