一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源的方法。所述方法包括親本選配、遠(yuǎn)緣雜交組合、雜種群體構(gòu)建、2n雄配子的鑒定、高效發(fā)生2n雄配子資源篩選等步驟。本發(fā)明利用遠(yuǎn)緣雜交手段，獲得高效發(fā)生2n雄配子的蘭花資源，為在沒有多倍體的條件下，利用有性雜交方法高效創(chuàng)建有性多倍體，有效促進(jìn)蘭花多倍體育種，培育突破性的蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2η雄配子資源的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2η雄配子資源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭花{Cymbidiim )是世界名花，集觀賞、經(jīng)濟(jì)和文化價(jià)值于一身，深受世界各國人們的青睞。我國是蘭花資源最豐富的國家，已知有49種，占世界總數(shù)的三分之二以上(劉仲健等，2006)，國外利用這些資源，在英國皇家學(xué)會已登錄蘭花集體雜種近15000個(gè)，并培育出大量的商業(yè)化品種，但國內(nèi)培育出的蘭花新品種和登錄的雜種均較少，而具有商業(yè)化前景的品種數(shù)就更稀少。種質(zhì)資源是育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，創(chuàng)造關(guān)鍵性的種質(zhì)資源是培育具有突破性品種的關(guān)鍵，因此研究種質(zhì)資源的創(chuàng)新方法對更好利用我國蘭花資源，培育具有突破性的蘭花新品種具有十分重要的意義。
[0003]多倍體育種是蘭花育種的重要手段，目前商業(yè)化的大花蕙蘭品種多為多倍體(朱根發(fā)等，2006)，而創(chuàng)建多倍體資源是開展蘭花多倍體育種的關(guān)鍵。蘭花多倍體資源的創(chuàng)建可以通過物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法，與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)法創(chuàng)造多倍體的方法相比，利用生物學(xué)(2n配子途徑)創(chuàng)建多倍體具有獨(dú)特的優(yōu)越性，它不僅可直接獲得三倍體，四倍體資源，而且可以傳遞親本更高的雜合性以及能夠克服雜種不育。目前國內(nèi)外學(xué)者，利用2n雄配子途徑已經(jīng)成功獲得百合；(Barba-Gonzalez et al, 2006; Barba-Gonzalez et al,2005)、月季(Crespel et al，2006)、秋海棠(Dewitte et al, 2010)和彩色馬蹄蓮(吳紅芝等，2011)等具有重要的觀賞價(jià)值的多倍體資源。
[0004]2n雄配子可自然發(fā)生也可以人工誘導(dǎo)，人工誘導(dǎo)2n雄配子的主要方法有物理方法和化學(xué)方法。物理方法包括溫度激變、氣體誘變和電離輻射等?；瘜W(xué)方法包括秋水仙素、安磺靈(Oryzalin)及氟樂靈(Trifluralin )以及咖啡堿等。目前在蘭花育種中，人工誘導(dǎo)2n雄配子的研究報(bào)道較少，范彬等(2012)利用秋水仙素誘導(dǎo)春劍2n雄配子，其最高誘導(dǎo)率為2.65%、P WongprichAC (活性炭)han et al (2013)利用N20成功誘導(dǎo)蝴蝶蘭2n雄配子。無論是物理方法或是化學(xué)方法誘導(dǎo)2n雄配子，均存在2n雄配子競爭力下降，誘導(dǎo)率偏低和效率不穩(wěn)定等問題，這導(dǎo)致2n雄配子無法有效的運(yùn)用于育種實(shí)踐。
[0005]因此，創(chuàng)建自然高效發(fā)生2n雄配子的蘭花資源成為開展蘭花多倍體育種的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中物理方法和化學(xué)方法誘導(dǎo)2n雄配子，均存在2n雄配子競爭力下降，誘導(dǎo)率偏低和效率不穩(wěn)定的缺陷，提供一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源的方法。本發(fā)明與傳統(tǒng)物理、化學(xué)方法相比，2n雄配子發(fā)生穩(wěn)定、活力高、可長期重復(fù)使 用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源的方法，其特征在于，包括如下步驟:51.遠(yuǎn)緣雜交組合配置:選擇適宜親本，配置雜交組合，在適宜的條件下栽培母本植株，獲得果實(shí)；52.雜種群體構(gòu)建:對果實(shí)進(jìn)行消毒，取其種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)獲得中間繁殖體，對中間繁殖體進(jìn)行植株再生，獲得試管苗，試管苗移栽后，栽培至植株開花；
53.2n雄配子的鑒定:待植株開花后，取不同株系植株新鮮成熟花粉，采用直接壓片法制片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率；
54.高效發(fā)生2n雄配子資源篩選:對發(fā)生率大于1%的植株進(jìn)行分株繁殖，并進(jìn)行兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的株系為蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，步驟S1所述遠(yuǎn)緣雜交組合配制技術(shù)包括以下步驟:
親本的選配原則:遠(yuǎn)緣雜交常存在雜交不親和性的問題，親本的親緣關(guān)系不能太遠(yuǎn)，應(yīng)該注意選配親和性相對較高的品種，親本的花粉活力要高；其次避免選擇第一次開花的蘭株做親本；最后選擇種子易于萌發(fā)的品種做親本，以保證可以獲得雜種后代。
[0009]雜交技術(shù):選擇健壯無病的植株作父母本，用鑷子取出母本當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，然后將父本的花粉塊放入母本的蕊腔中，用鉛筆在紙牌上寫明雜交組合的名稱，雜交時(shí)間，掛在母本植株上，并將其置于溫暖通風(fēng)的地方，防止寒潮。
[0010]步驟S2所述雜種群體構(gòu)建技術(shù)包括以下步驟:
S21.果莢的消毒與種子萌發(fā):將剛采收的果實(shí)用自來水沖洗2~3 min，晾干后在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡30s，轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒15min，無菌水沖洗3~5次后備用。用解剖刀切去果莢兩端約0.5 cm，然后將果實(shí)縱向切開，將種子均勻撒播于適宜的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，并在適宜的溫度條件進(jìn)行暗培養(yǎng)。
[0011]S22中間繁殖體的增殖與植株再生:將萌發(fā)形成的中間繁殖體切塊，接種到適宜的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繁殖，經(jīng)繼代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到適宜的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。分化出的芽和苗轉(zhuǎn)入適宜的生根壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根壯苗。
[0012]S23.試管苗移栽:當(dāng)小苗長至5~8 cm并具有2條以上根時(shí)即可進(jìn)行煉苗。煉苗時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子旋松，放在溫室下10~20 d或在室外無直射光的地方放置3~5 d后，取出試管苗移栽。
[0013]步驟S21所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+ 0.2~0.5 mg/L 6BA + 0.2~0.5 m g/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 +100ml/L Cff (椰子汁)+ 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0014]S22 所述增殖培養(yǎng)基為 1/2 MS+ 0.5 ~1.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0015]S22 所述分化培養(yǎng)基為 1/2MS+ 1.5 ~2.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA+30g/L鹿糖+7.5g/L卡拉粉。
[0016]S22 所述生根壯苗培養(yǎng)基為 1/2MS+ (λ 1 ~0.2 mg/L 6BA +0.5 ~L 0 mg/L NAA+20g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，步驟S3所述2n雄配子的鑒定技術(shù)包括以下步驟:
S31制片:取出新鮮花粉塊，放在干凈的載玻片上，為防止花粉干燥，滴入少量無菌水，
用鑷子使花粉均勻分散在載玻片上。
[0018]S32.染色:待載玻片上材料水分晚干后，在材料上方均勾抹上一層改良石炭fe品紅染液，快速經(jīng)過火焰2~3次。染色時(shí)間大約3-5分鐘。
[0019]S33.壓片:用帶橡皮的鉛筆垂直輕敲蓋玻片，趕出氣泡。
[0020]S34.觀察:用01ympus-1X71倒置顯微鏡觀察2η花粉發(fā)生頻率，在40 X物鏡下，移動載玻片，隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行拍照，最后統(tǒng)計(jì)這10個(gè)視野中的二分體和三分體發(fā)生的頻率。觀察時(shí)，以100個(gè)小孢子母細(xì)胞為1次重復(fù)，重復(fù)3次。
[0021]S35.統(tǒng)計(jì):2η雄配子發(fā)生的頻率按照如下公式統(tǒng)計(jì):
2η 雄配子的頻率(％)= (2D+Tr) / (2D+3Tr +4Te) X 100 ；其中D代表二分體；Tr代表三分體；Te代~表四分體。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，步驟S4所述分株繁殖技術(shù)包括以下步驟:分株繁殖技術(shù):蘭花分株繁殖在休眠期進(jìn)行，最好在新芽已經(jīng)形成但尚未出土前。蘭花株屬于叢生型，不同品種分株方法稍有差別，分株時(shí)用一只手按住植株莖部的盆土，另一只手將盆翻倒出來，輕輕搖動基質(zhì)和盆壁分離，然后將蘭叢取出，輕輕將基質(zhì)破碎，使之和蘭根分離，然后從間隙較大處，用已經(jīng)消毒的利刀將蘭叢按2~3株一蔸切開洗凈，去掉老根、爛根、枯葉，放置1天左右，待蘭根返白時(shí)即可以上盆。蘭花分株后根系活力相對較弱，應(yīng)注意保溫、保濕管理，以提高植株成活力。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過遠(yuǎn)緣雜交的方法，可獲得穩(wěn)定高效發(fā)生2n雄配子的蘭花資源，較物理或是化學(xué)的方法，2n雄配子發(fā)生穩(wěn)定，可長期重復(fù)使用，形成的2n雄配子活力高。這對促進(jìn)蘭花多倍體育種和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提高我國蘭花產(chǎn)業(yè)的核心競爭力具有十分重要的意義。
[0024]說明書附圖
圖1.墨蘭2n雄配子的鑒定結(jié)果；其中a~d后期II a.一分體；b.二分體；c.三分體；
d.正常四分體；e~h成熟花粉時(shí)期e.—分體f.二分體；g.三分體；h.正常四分體花粉。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0026]實(shí)施例1金嘴X兔耳蘭雜種高效2n雄配子資源的創(chuàng)建
S1.遠(yuǎn)緣雜交組合配置:金嘴墨蘭花期，選擇健壯無病的植株作母本，取兔耳蘭花粉塊為其授粉，用鉛筆在塑料紙牌上標(biāo)明雜交組合名稱、雜交時(shí)間，掛在母本植株上。在適宜的條件下栽培母本植株，獲得果實(shí)。
[0027]S2.雜種群體構(gòu)建
S21.果莢的消毒與種子萌發(fā):將剛采收的果實(shí)用解剖刀去掉果柄，蘸取適量洗潔精清洗后用自來水沖洗2~3 min,晾干后在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡30s，轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒15min，無菌水沖洗5~8次后備用。用解剖刀切去果莢兩端約0.5 cm，然后將果實(shí)縱向切開，將種子均勻撒播于1/2 MS培養(yǎng)基+ 0.2~0.5 mg/L 6BA + 0.2~0.5 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉+100ml/L Cff (椰子汁)+ 0.5 g/L AC (活性炭))培養(yǎng)基中，并與26 ± 1 °C黑暗環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0028]S22.中間繁殖體的增殖與植株再生:將萌發(fā)形成的中間繁殖體切塊接種到1/2MS+ 0.5 ~1.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，經(jīng)多代培養(yǎng)后再接種到1/2MS+ 1.5~2.0 mg/L6BA + 0.2~0.5 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L卡拉粉的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，分化出的芽和苗轉(zhuǎn)入如下生根壯苗培養(yǎng)基中:1/2MS+ 0.1~0.2 mg/L 6BA +0.5~1.0 mg/L NAA+20g/L 蔗糖 +7.5g/L + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0029]以上實(shí)驗(yàn)均在溫度26±1°C，光照強(qiáng)度17Mfflol.m-2 -s^1每天12h光照下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030]S23.試管苗移栽:當(dāng)小苗長至5~8 cm并具有2條以上根時(shí)即可進(jìn)行煉苗。煉苗時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子旋松，放在溫室下10~20 d或在室外無直射光的地方放置3~5 d后，取出試管苗移栽。
[0031]S3.2n雄配子的鑒定技術(shù)包括制片、染色、壓片、觀察和統(tǒng)計(jì):
S31.制片:取出新鮮花粉塊，放在干凈的載玻片上，為防止花粉干燥，滴入少量無菌水，用鑷子使花粉均勻分散在載玻片上。
[0032]S32.染色:待載玻片上材料水分晚干后，在材料上方均勾抹上一層改良石炭fe品紅染液，快速經(jīng)過火焰2~3次。染色時(shí)間大約3~5分鐘。
[0033]S33.壓片:用帶橡皮的鉛筆垂直輕敲蓋玻片，趕出氣泡。
[0034]S34.觀察:用01ympus-1X71倒置顯微鏡觀察2n花粉發(fā)生頻率，在40 X物鏡下，移動載玻片，隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行拍照，最后統(tǒng)計(jì)這10個(gè)視野中的二分體和三分體發(fā)生的頻率。觀察時(shí)，以100個(gè)小孢子母細(xì)胞為1次重復(fù)，重復(fù)3次。觀察結(jié)果見圖1。
[0035] S35.統(tǒng)計(jì):2η雄配子發(fā)生的頻率按照如下公式統(tǒng)計(jì):
2η 雄配子的頻率(％)= (2D+Tr) / (2D+3Tr +4Te) X 100 ；
其中D代表二分體；Tr代表三分體；Te代表四分體。
[0036]S4.高效發(fā)生2n雄配子資源篩選:對發(fā)生率大于1%的植株進(jìn)行分株繁殖，并進(jìn)行兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的株系為蘭花高效發(fā)生2n雄配子資源。所述分株繁殖技術(shù)包括如下步驟:蘭花分株繁殖在休眠期進(jìn)行，最好在新芽已經(jīng)形成但尚未出土前。蘭花株屬于叢生型，不同品種分株方法稍有差別，分株時(shí)用一只手按住植株莖部的盆土，另一只手將盆翻倒出來，輕輕搖動基質(zhì)和盆壁分離，然后將蘭叢取出，輕輕將基質(zhì)破碎，使之和蘭根分離，然后從間隙較大處，用已經(jīng)消毒的利刀將蘭叢按2~3株一蔸切開洗凈，去掉老根、爛根、枯葉，放置1天左右，待蘭根返白時(shí)即可以上盆。蘭花分株后根系活力相對較弱，應(yīng)注意保溫、保濕管理，以提高植株成活力。
[0037]結(jié)果與分析:
通過壓片法觀察了金嘴，兔耳蘭及其雜種株系2n雄配子的發(fā)生(見表1和表2)。結(jié)果表明，金嘴和兔耳蘭2n雄配子發(fā)生頻率分別為0.45%和0.56%，而在其雜種后代中有3份株系的2n雄配子發(fā)生頻率大于2%，8份株系的發(fā)生頻率介于1~2%之間。將2n雄配子的發(fā)生頻率大于1%的株系篩選出來，在不同的年份中進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證(表3)。結(jié)果表明，多數(shù)高頻率發(fā)生2n雄配子株系，在不同年份的2n雄配子發(fā)生頻率雖有波動，但變化幅度小，且在1%以上，明顯高于雙親的2n雄配子發(fā)生頻率。這證明利用遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)建高效發(fā)生2n雄配子資源是可行的。
[0038]表1 2012年金嘴X兔耳蘭雜種2n雄配子的發(fā)生
【權(quán)利要求】
1.一種創(chuàng)建蘭花高效發(fā)生2η雄配子資源的方法，其特征在于，包括如下步驟:51.遠(yuǎn)緣雜交組合配置:選擇適宜親本，配置雜交組合，在適宜的條件下栽培母本植株，獲得果實(shí)；52.雜種群體構(gòu)建:對果實(shí)進(jìn)行消毒，取其種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)獲得中間繁殖體，對中間繁殖體進(jìn)行植株再生，獲得試管苗，試管苗移栽后，栽培至植株開花；53.2η雄配子的鑒定:待植株開花后，取不同株系植株新鮮成熟花粉，采用直接壓片法制片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察2η花粉，統(tǒng)計(jì)2η花粉的發(fā)生頻率；54.高效發(fā)生2η雄配子資源篩選:對發(fā)生率大于1%的植株進(jìn)行分株繁殖，并進(jìn)行兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的株系為蘭花高效發(fā)生2η雄配子資源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S1所述適宜親本的選配原則為首先選配親和性相對較高的品種，親本的花粉活力要高；其次避免選擇第一次開花的蘭株做親本；最后選擇種子易于萌發(fā)的品種做親本，以保證可以獲得雜種后代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S1所述雜交組合的雜交方法為:用鑷子取出母本當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，將父本的花粉塊放入母本的蕊腔中，用鉛筆在紙牌上寫明雜交組合的名稱，雜交時(shí)間，掛在母本植株上，并將其置于溫暖通風(fēng)的地方，防止寒潮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S2所述雜種群體構(gòu)建包括如下步驟:541.果莢的消毒與種子萌發(fā):將剛采收的果實(shí)經(jīng)消毒處理后，用解剖刀切去果莢兩端0.5 cm，然后將果實(shí)縱向切開取出種子，將種子均勻撒播于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，在適宜的溫度條件進(jìn)行暗培養(yǎng)獲得中間繁殖體；542.中間繁殖體的增殖與植株再生:`將種子萌發(fā)形成的中間繁殖體切塊，接種到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繁殖，經(jīng)繼代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，分化出的芽和苗轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根壯苗；`543.試管苗移栽:當(dāng)小苗長至5~8cm并具有2條以上根時(shí)即可進(jìn)行煉苗；煉苗時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子旋松，放在溫室下10~20 d或在室外無直射光的地方放置3~5 d后，取出試管苗移栽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，S41所述消毒處理為將剛采收的果實(shí)用自來水沖洗2~3 min,晾干后用75%的酒精浸泡30s，然后將果實(shí)轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒15min,無菌水沖洗3~5次后備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，S41所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+ 0.2 ~0.5 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 m g/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 +100ml/L椰子汁+ 0.5 g/L活性炭。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，S42所述增殖培養(yǎng)基為1/2MS+ 0.5~1.0mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 鹿糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L 活性炭。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，S42所述分化培養(yǎng)基為1/2MS+1.5~2.0mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 鹿糖 +7.5g/L 卡拉粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，S42所述生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.1~`0.2 mg/L 6BA +0.5 ~1.0 mg/L NAA +20g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L 活性炭。
【文檔編號】A01H1/02GK103704126SQ201310668763
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】張志勝, 朱嬌, 曾瑞珍, 謝利, 周玉亮, 郭和蓉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)