專利名稱：北蟲草最佳組織分離期篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種北蟲草，特別涉及一種北蟲草最佳組織分離期篩選方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草又稱北蟲草、蛹蟲草，隸屬于子囊菌門，盤菌亞門，糞殼菌綱，肉座菌目，麥角菌科蟲草屬。目前世界上已發(fā)現(xiàn)蟲草屬真菌400多種，我國記錄有100種。北蟲草是蟲草屬真菌的模式種，其宿主主要為鱗翅目的蠶蛾科、舟蛾科、天蠶蛾科等，它是由子座(即草部分)與菌核(即蟲或蛹的尸體部分)兩部分組成的復(fù)合體子座有單生或數(shù)個(gè)，從寄主頭部或節(jié)部長出，呈橙黃色。冬季幼蟲蟄居土里，菌類寄生其中吸收營養(yǎng)，最后其體內(nèi)充滿菌絲而死，而蛹蟲尸體卻完好無損；到了夏季，自其尸體之上生出“幼苗”(子實(shí)體)，形似草，夏至前后采集而得其主要分布在吉林、遼寧、陜西、河北、遼寧、湖北、廣東等地。北蟲草是冬蟲夏草的同屬異種真菌，兩者的化學(xué)成分和營養(yǎng)成分以及藥用功效都十分相似，北冬蟲夏草中的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖和蛋白質(zhì)含量明顯高于天然冬蟲夏草，其含量分別為冬蟲夏草的29倍、27倍和32倍，而氨基酸含量基本接近，食用和藥用價(jià)值可與天然冬蟲夏草相媲美，是天然冬蟲夏草的理想代用品。20世紀(jì)90年代以來，對作為藥物和保健產(chǎn)品的北蟲草的藥化、藥理、毒理和毒性進(jìn)行了大量的研究和安全評價(jià)、證明了人工栽培的北蟲草無毒副作用，它具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、補(bǔ)肺益腎、鎮(zhèn)靜、平喘、抗心率失常、抗疲勞、抑制瘍細(xì)胞、治療肺結(jié)核、抗疲勞、抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞等特殊功效，而且可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，可以與人參、鹿茸相媲美，再加上資源奇缺，采集困難，因此，有“國寶”之譽(yù)。北冬蟲夏草和冬蟲夏草是我國最常見的分布最廣的藥用價(jià)值極高的兩種蟲草菌，國外也對北冬蟲夏草進(jìn)行了研究。20世紀(jì)60年代，加拿大、美國、德國等，已對蟲草進(jìn)行研究，日本于1900年成立了“北冬蟲夏草研究會(huì)”與中國醫(yī)學(xué)專家互相交流，使北蟲草的研究取得了較快的發(fā)展。野生的北冬蟲夏草在自然界數(shù)量很少，價(jià)格昂貴。北蟲草人工栽培馴化已獲得成功，可進(jìn)行商·業(yè)化生產(chǎn)，但生產(chǎn)中所使用的菌種大多是用野生蟲草分離得到的，關(guān)于北蟲草組織分離的報(bào)道很少，而北蟲草生長發(fā)育不同時(shí)期組織分離母種的研究則更是未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種長速最快、長勢最好、轉(zhuǎn)色最快、轉(zhuǎn)色效果較好的北蟲草最佳組織分離期篩選方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的:本發(fā)明的北蟲草最佳組織分離期篩選方法，選用北蟲草子實(shí)體的五個(gè)不同生長發(fā)育期，即原基、子實(shí)體生長15天、子實(shí)體生長30天、子實(shí)體生長45天、子實(shí)體生長60天的組織進(jìn)行母種分離，以便篩選最優(yōu)的組織分離材料，該篩選方法具體步驟如下:(I)選取培養(yǎng)基與配制配方:馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO40.5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是:先將配方中各組分用電子天平稱量好，然后將稱好的馬鈴薯切成條狀，放入沸水中煮20-30分鐘，期間用玻璃棒不斷攪拌，以防馬鈴薯被煮焦；再將煮好的馬鈴薯用紗布過濾兩遍，取濾液；然后將濾液放到電磁爐上邊加熱邊將瓊脂加入其中，并用玻璃棒不斷攪拌，最后將其它成分依次加入其中；待各種組分充分溶解后，定容至1000ml,用180mmX 18mm的試管分裝,每支試管分裝8ml,加蓋棉塞，并蓋幾層報(bào)紙，置高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，121°C維持30分鐘，然后取出擺斜面，冷卻，無菌檢驗(yàn)后待用;(2)組織分離，北蟲草母種分離材料的選取與采樣:分離材料選取的前提條件是栽培中未被污染，分別在五個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期選取生長發(fā)育良好的蟲草作為組織分離的材料，具體方法如下，原基時(shí)期的選取原基較多、分布均勻的栽培瓶，子實(shí)體時(shí)期的選取蟲草形態(tài)良好，生長健壯的子實(shí)體，將選好的栽培瓶放入無菌操作室內(nèi)待用；組織分離接種與培養(yǎng):接種前將接種所用工具及擺好斜面的培養(yǎng)基試管放到超凈工作臺中，然后將接種室和超凈工作臺中的紫外燈打開，照射30分鐘之后暗處理20分鐘，在超凈工作臺內(nèi)用酒精棉球擦拭雙手和栽培瓶外表，然后在酒精燈火焰旁打開栽培瓶的封口膜，原基直接用接種鋤挑取一小塊接入到培養(yǎng)基中央，對于其他時(shí)期的分離材料，用無菌剪刀剪取蟲草子實(shí)體上端一小截，然后用接種鋤接入到培養(yǎng)基上，每一時(shí)期的蟲草分別接10支，然后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)23°C下培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄不同時(shí)期的組織塊在培養(yǎng)基上的定植萌發(fā)及菌絲生長情況；(3)轉(zhuǎn)色，將培養(yǎng)完成的長滿菌絲體的試管置于溫度為20°C有散射光照射的環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)色，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色速度，七日后觀察不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色率；(4)第(2)、⑶步驟重復(fù)三次。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:北蟲草不同時(shí)期組織分離得到的菌絲體生長情況差異顯著，得到了較為理想的北蟲草母種組織分離時(shí)期。北蟲草原基期進(jìn)行組織分離得到的母種菌絲體生長速度最快，為3.18mm/d，與其它四個(gè)時(shí)期組織分離得到的母種菌絲體生長速度有極顯著差異，該時(shí)期分離得到的菌絲體長勢也明顯優(yōu)于其它四個(gè)時(shí)期分離得到的母種菌絲體，菌絲體生長整齊、純白、濃密、轉(zhuǎn)色效果好，為北蟲草最佳的組織分離期。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例:本發(fā)明的北蟲草最佳組織分離期篩選方法，選用北蟲草子實(shí)體的五個(gè)不同生長發(fā)育期，即原基、子實(shí)體生長15天、子實(shí)體生長30天、子實(shí)體生長45天、子實(shí)體生長60天的組織進(jìn)行母種分離，以便篩選最優(yōu)的組織分離材料，該篩選方法具體步驟如下:(I)選取培養(yǎng)基與配制配方:馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO40.5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是:先將配方中各組分用電子天平稱量好，然后將稱好的馬鈴薯 切成條狀，放入沸水中煮20-30分鐘，期間用玻璃棒不斷攪拌，以防馬鈴薯被煮焦；再將煮好的馬鈴薯用紗布過濾兩遍，取濾液；然后將濾液放到電磁爐上邊加熱邊將瓊脂加入其中，并用玻璃棒不斷攪拌，最后將其它成分依次加入其中；待各種組分充分溶解后，定容至IOOOml,用180mmX 18mm的試管分裝,每支試管分裝8ml,加蓋棉塞，并蓋幾層報(bào)紙，置高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，121°C維持30分鐘，然后取出擺斜面，冷卻，無菌檢驗(yàn)后待用;(2)組織分離，北蟲草母種分離材料的選取與采樣:分離材料選取的前提條件是栽培中未被污染，分別在五個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期選取生長發(fā)育良好的蟲草作為組織分離的材料，具體方法如下，原基時(shí)期的選取原基較多、分布均勻的栽培瓶，子實(shí)體時(shí)期的選取蟲草形態(tài)良好，生長健壯的子實(shí)體，將選好的栽培瓶放入無菌操作室內(nèi)待用；組織分離接種與培養(yǎng):接種前將接種所用工具及擺好斜面的培養(yǎng)基試管放到超凈工作臺中，然后將接種室和超凈工作臺中的紫外燈打開，照射30分鐘之后暗處理20分鐘，在超凈工作臺內(nèi)用酒精棉球擦拭雙手和栽培瓶外表，然后在酒精燈火焰旁打開栽培瓶的封口膜，原基直接用接種鋤挑取一小塊接入到培養(yǎng)基中央，對于其他時(shí)期的分離材料，用無菌剪刀剪取蟲草子實(shí)體上端一小截，然后用接種鋤接入到培養(yǎng)基上，每一時(shí)期的蟲草分別接10支，然后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)23°C下培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄不同時(shí)期的組織塊在培養(yǎng)基上的定植萌發(fā)及菌絲生長情況；(3)轉(zhuǎn)色，將培養(yǎng)完成的長滿菌絲體的試管置于溫度為20°C有散射光照射的環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)色，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色速度，七日后觀察不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色率；(4)第(2)、⑶步驟重復(fù)三次。通過上述步驟得出以下表格，表I不同時(shí)期組織分離母種菌絲體生長情況及多重比較結(jié)果單位mm/d
權(quán)利要求
1.一種北蟲草最佳組織分離期篩選方法，其特征在于，選用北蟲草子實(shí)體的五個(gè)不同生長發(fā)育期，即原基、子實(shí)體生長15天、子實(shí)體生長30天、子實(shí)體生長45天、子實(shí)體生長60天的組織進(jìn)行母種分離，以便篩選最優(yōu)的組織分離材料，該篩選方法具體步驟如下 (1)選取培養(yǎng)基與配制配方馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO4O. 5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是先將配方中各組分用電子天平稱量好，然后將稱好的馬鈴薯切成條狀，放入沸水中煮20-30分鐘，期間用玻璃棒不斷攪拌，以防馬鈴薯被煮焦；再將煮好的馬鈴薯用紗布過濾兩遍，取濾液；然后將濾液放到電磁爐上邊加熱邊將瓊脂加入其中，并用玻璃棒不斷攪拌，最后將其它成分依次加入其中；待各種組分充分溶解后，定容至1000ml,用180mmX 18mm的試管分裝,每支試管分裝8ml,加蓋棉塞,并蓋幾層報(bào)紙，置高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，121°C維持30分鐘，然后取出擺斜面，冷卻，無菌檢驗(yàn)后待用； (2)組織分離，北蟲草母種分離材料的選取與采樣分離材料選取的前提條件是栽培中未被污染，分別在五個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期選取生長發(fā)育良好的蟲草作為組織分離的材料，具體方法如下，原基時(shí)期的選取原基較多、分布均勻的栽培瓶，子實(shí)體時(shí)期的選取蟲草形態(tài)良好，生長健壯的子實(shí)體，將選好的栽培瓶放入無菌操作室內(nèi)待用；組織分離接種與培養(yǎng)接種前將接種所用工具及擺好斜面的培養(yǎng)基試管放到超凈工作臺中，然后將接種室和超凈工作臺中的紫外燈打開，照射30分鐘之后暗處理20分鐘，在超凈工作臺內(nèi)用酒精棉球擦拭雙手和栽培瓶外表，然后在酒精燈火焰旁打開栽培瓶的封口膜，原基直接用接種鋤挑取一小塊接入到培養(yǎng)基中央，對于其他時(shí)期的分離材料，用無菌剪刀剪取蟲草子實(shí)體上端一小截，然后用接種鋤接入到培養(yǎng)基上，每一時(shí)期的蟲草分別接10支，然后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)23°C下培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄不同時(shí)期的組織塊在培養(yǎng)基上的定植萌發(fā)及菌絲生長情況； (3)轉(zhuǎn)色，將培養(yǎng)完成的長滿菌絲體的試管置于溫度為20°C有散射光照射的環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)色，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色速度，七日后觀察不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色率； (4)第(2)、(3)步驟重復(fù)三次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種北蟲草最佳組織分離期篩選方法，選用北蟲草子實(shí)體的五個(gè)不同生長發(fā)育期，即原基、子實(shí)體生長15天、子實(shí)體生長30天、子實(shí)體生長45天、子實(shí)體生長60天的組織進(jìn)行母種分離，以便篩選最優(yōu)的組織分離材料，通過上述篩選方法可以得出，北蟲草生長至原基時(shí)期組織分離得到的母種菌絲體長速最快、長勢最好、轉(zhuǎn)色最快、轉(zhuǎn)色效果最好，所以北蟲草生長至原基時(shí)是最適合做母種組織分離的時(shí)期，原因是與北蟲草生長不同時(shí)期的菌絲體細(xì)胞活力有關(guān)，原基時(shí)期的菌絲體細(xì)胞分化程度最低，細(xì)胞活力最高，在這個(gè)時(shí)期進(jìn)行組織分離得到的母種活力最好，長勢也最好。
文檔編號A01G1/04GK103250566SQ201310185768
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者賀曉龍, 任桂梅, 高小朋, 鄧振山, 劉佳, 王殿振, 劉年強(qiáng), 郝文娟 申請人:延安大學(xué)