專利名稱：一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)技術領域，特別是涉及生物能源植物柳枝稷的組織培養(yǎng)技術。
背景技術：
柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名n'rgai應),又稱“能源草”,因其栽培技術簡單，適應性廣，防風固沙能力強，耐貧瘠，生物學產量高，被國際上確定為生產染料乙醇的首選生物能源植物，并投入了大量的人力、物力進行研究開發(fā)。利用轉基因技術對能源植物進行遺傳改良是現(xiàn)代基因工程技術在農業(yè)領域運用的新突破。柳枝稷作為一種重要的新型生物能源植物，已經成為基因轉化的主要目標之一。其中，采用轉基因技術增強柳枝稷的抗逆性，提高光和效率，增加生物學產量，降低木質素含量和提高乙醇產率等方面已成為目前的研究熱點并展示出良好的應用前景。然而，與大多數(shù)禾本科植物的組織培養(yǎng)相似，柳枝稷在人工誘導愈傷組織方面也存在著很多困難。因此，加強柳枝稷的通過愈傷組織再生植株的體外繁殖方法的研究就很有必要，對柳枝稷的生物技術研究將起到很大的促進作用。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有柳枝稷體外繁殖技術存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種柳枝稷的體外繁殖方法，以拓寬柳枝稷組織培養(yǎng)和遺傳轉化的基因型范圍，以實現(xiàn)利用轉基因技術對能源植物進行遺傳改良，進而實現(xiàn)現(xiàn)代基因工程技術在農業(yè)領域應用的新突破。本發(fā)明的目的是這樣 實現(xiàn)的:一種采用柳枝稷種子組織培養(yǎng)育苗方法，其特種在于它包括以下工藝步驟:
選取100顆飽滿的種子(鮮重為0.225 g，選取的種子長度在0.2 0.5 cm，寬度為0.Γ0.2 cm)做為實驗使用材料，
(I)、種子處理
a將柳枝稷種子6%(v/v) NaClO中浸泡2 h，按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子放入5^10 ml 6%(v/v) NaClO中，期間不停攪拌；b用蒸餾水清洗3遍后，于暗處靜置過夜；
c按每鮮重0.225 g柳枝稷種子用5 10 ml 6% (v/v) NaClO浸泡20 min ； d將種子清洗后，在無菌條件下，將其接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷誘導培養(yǎng)。(2)、愈傷組織及芽的誘導
將接種的培養(yǎng)基轉移至培養(yǎng)箱，每天光照14 h，光照強度1400-1500 lux，溫度23 V±1 V，無菌條件下培養(yǎng):Γ5 d后，種子開始萌動，I周后開始有愈傷形成，并伴隨有新芽或者新葉的形成，誘導愈傷選用培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基，補充2，4-D 5 mg/L,6-BA 1.2mg/L, NAA 1.0 mg/L，pH 為 5.8。(3)、生根培養(yǎng)
4周后，在無菌條件下將新長成的愈傷組織轉移至生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基選用MS基礎培養(yǎng)基，補充2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L,NAA 1.5 mg/L，pH為 5.8。溫度 23 °C ± I°C，光照14 h，光強150(T2000 lux, 7^10 d后開始生根，且速度較快，2周后，可將生根的柳枝稷苗進行過渡栽培。其中，步驟(I) d中愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基上添加2，4-D 5飛mg/L，6-BA 1.2 1.5 mg/L, NAA 1.(Tl.2 mg/L, pH 為 5.8。本發(fā)明的研究方法通過具體的實驗進行了描述，相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及結果:
本發(fā)明采用柳枝稷種子組織培育方法，既可繁殖優(yōu)良品種，又可從種子實生苗中選取優(yōu)異的株苗用作遺傳轉化實驗，避免花費大量金錢和精力。本發(fā)明方法可行，操作簡單，可以為人們進行雜交育種及遺傳轉化實驗，提供了一種有效的途徑?？s短了柳枝稷的培養(yǎng)周期，利用正交實驗，摸索出能誘導柳枝稷愈傷組織形成的最適激素配比，能在較大程度上促進愈傷及生芽、生根的形成，縮短柳枝稷的培養(yǎng)周期。


圖1為接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上3 d后萌動的種子照片；
圖2為接種10 d后種子形成愈傷及胚芽的照片；
圖3為接種14 d后 在培養(yǎng)基上形成大量分化組織的照片；
圖4為在生根培養(yǎng)基上形成的生根的柳枝稷的照片；
圖5為煉苗的照片。以上附圖為實施例一中的實驗效果圖。
具體實施方式
:
下面結合實例和附圖詳細說明
6-BA 6-b 節(jié)氨基嘌吟(6-BenzylaminoPurine)
NAA a_ 蔡乙酸(1-NaPhthylaceticacid)
2, 4-D 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)
實施例一:
本發(fā)明選擇柳枝稷種子為外植體，在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素配比，誘導愈傷組織，分化及生根誘導。具體生產過程為:
選取外植體
選取成熟飽滿的柳枝稷種子100顆(0.225 g)。愈傷誘導及芽分化
將種子置于培養(yǎng)皿中，采用10 ml 6% (v/v) NaClO進行表面消毒2 h，期間置于搖床上不停攪拌；
棄去次氯酸鈉，清洗干凈，用蒸餾水浸泡過夜；
用10 ml 6%(v/v)的NaClO消毒20 min,無菌條件下放入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為 MS 基礎培養(yǎng)基上添加 2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.0 mg/L, pH 為 5.8。
24°C，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T15 d誘導獲得愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)3(T40 d時，可從愈傷組織中再生出大量的叢生芽，具體實驗效果見圖1，圖2和圖3。經過統(tǒng)計，100顆柳枝稷成熟種子(0.225 g)誘導芽分化率可達到90%以上。叢生芽生根培養(yǎng)
轉移分化成芽的愈傷組織至生根培養(yǎng)基上進行生根誘導培養(yǎng)，240C，光照條件下培養(yǎng)2(T30 d，誘導生根，得到再生植株(圖4)。其中，生根培養(yǎng)基配方為MS基礎培養(yǎng)基上添加2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。移栽至溫室
打開培養(yǎng)瓶封口，將再生植株煉苗4飛d，移栽至溫室即可(圖5)。
實施例二:
本發(fā)明選擇柳枝稷種子為外植體，在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素配比，誘導愈傷組織，分化及生根誘導。具體生產過程為:
(I)選取外植體 選取成熟飽滿的柳枝稷種子100顆(0.225 g)。

(2)愈傷誘導及芽分化
將種子置于培養(yǎng)皿中，采用5 ml 6%(v/v)的NaClO表面消毒2 h，期間置于搖床上不停攪拌；
棄去次氯酸鈉，清洗干凈，用蒸餾水浸泡過夜；
用5 ml 6% (v/v)的NaClO鈉消毒20 min,無菌條件下放入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為 MS 基礎培養(yǎng)基上添加 2，4-D 6 mg/L，6-BA 1.5 mg/L, NAA 1.2 mg/L, pH 為 5.8。24°C，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 20 d誘導獲得愈傷組織，分化培養(yǎng)，30^40 d時，可從愈傷組織中再生出大量的叢生芽。經過統(tǒng)計，100顆柳枝稷成熟種子(0.225 g)誘導芽分化率只能達到40%左右。(3)叢生芽生根培養(yǎng)
轉移分化成芽的愈傷組織至生根培養(yǎng)基上進行生根誘導培養(yǎng)，240C，光照條件下培養(yǎng)2(T30 d，誘導生根，得到再生植株。其中，生根培養(yǎng)基配方為MS基礎培養(yǎng)基上添加2，4-D 5mg/L, 6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。(4)移栽至溫室
打開培養(yǎng)瓶封口，將再生植株煉苗4飛d，移栽至溫室即可。
權利要求
1.一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，按照下述步驟進行: (1)種子處理 a將柳枝稷種子在6% v/v NaClO中浸泡2 h，按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子放入5-10 ml 6% v/v NaClO中，期間不停攬拌； b用蒸餾水清洗3遍后，于暗處靜置過夜； c按每鮮重為0.225 g柳枝稷種子用5-10 ml 6% v/v NaClO浸泡20 min ； d將種子清洗后，在無菌條件下，將其接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷誘導培養(yǎng); (2)愈傷組織及芽的誘導 將接種的培養(yǎng)基轉移至培養(yǎng)箱，每天光照14 h，光照強度1400-1500 lux，溫度23 V±1 V，無菌條件下培養(yǎng)3-5 d后，種子開始萌動，I周后開始有愈傷形成，并伴隨有新芽或者新葉的形成，誘導愈傷選用培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基，補充2，4-D 5 mg/L,6-BA 1.2mg/L, NAA 1.0 mg/L，pH 為 5.8 ; (3)生根培養(yǎng) 4周后，在無菌條件下將新長成的愈傷組織轉移至生根培養(yǎng)基上，溫度23 °C±1 V,光照14 h，光強150(T2000 lux, 7-10 d后開始生根，且速度較快，2周后，可將生根的柳枝稷苗進行過渡栽培。
2.根據(jù)權利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于步驟(l)d中愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基上添加2，4-D 5-6 mg/L,6-BA 1.2-1.5 mg/L，NAA1.(Tl.2 mg/L, pH 為 5.8。
3.根據(jù)權利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，其特征在于步驟(3)中所述生根培養(yǎng)基選用MS基礎培養(yǎng)基，補充2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH為 5.8。
4.一種用于權利要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗的愈傷組織誘導培養(yǎng)基，其成分為 MS 基礎培養(yǎng)基上添加 2，4-D 5-6 mg/L，6-BA 1.2-1.5 mg/L, NAA 1.0-1.2 mg/L，pH 為5.8ο
5.一種用于權利 要求1所述的柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗的生根培養(yǎng)基，其成分為MS基礎培養(yǎng)基補充 2，4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L, NAA 1.5 mg/L，pH 為 5.8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柳枝稷組織培養(yǎng)快速育苗方法，特別是涉及生物能源植物柳枝稷的組織培養(yǎng)技術。本發(fā)明按以下工藝步驟進行種子處理、愈傷組織及芽的誘導、生根培養(yǎng)。本發(fā)明采用柳枝稷種子組織培育方法，既可繁殖優(yōu)良品種，又可從種子實生苗中選取優(yōu)異的株苗用作遺傳轉化實驗，避免花費大量金錢和精力。本發(fā)明方法可行，操作簡單，可以為人們進行雜交育種及遺傳轉化實驗，提供了一種有效的途徑。
文檔編號A01C1/00GK103238519SQ20131017800
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月14日 優(yōu)先權日2013年5月14日
發(fā)明者楊冉, 黃萍, 杜道林, 楊淞惠, 祁珊珊 申請人:江蘇大學