專利名稱：獲得青蒿單倍體植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種獲得青蒿單倍體植株的方法。
背景技術(shù)：
青蒿(Artemisia annua L.)為菊科蒿屬一年生草本植物。青蒿素(artemisinin) 是從其植株地上部分提取的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前最有效的治療瘧疾的藥物。世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法。隨著近年來對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有抗血吸蟲、抗炎、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等功能，是一種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0. 01%-1%)，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成青蒿素的難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具備可行性。因此，通過傳統(tǒng)育種和基因工程育種手段培育青蒿素高產(chǎn)品系具有重要的實際應(yīng)用價值。青蒿為嚴重自交不親和植物，因此高產(chǎn)植株很難通過自交等傳統(tǒng)育種手段在短期內(nèi)獲得純合品系。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，如過量表達青蒿素合成途徑上的關(guān)鍵酶基因亦可以有效提高青蒿素含量，但是這同樣面臨由于自交不親和導(dǎo)致的高產(chǎn)性狀無法在轉(zhuǎn)基因后代中穩(wěn)定遺傳的難題。通過花藥培養(yǎng)培育單倍體進而通過施用秋水仙素等染色體加倍劑使染色體倍性恢復(fù)到正常水平是育種學(xué)家經(jīng)常采用且技術(shù)相對較為成熟的手段。該技術(shù)自上世紀50年代以來已被廣泛地應(yīng)用于很多植物，包括蔬菜、花卉和糧食作物?；谇噍锏淖越徊挥H和性，對于性狀優(yōu)良、青蒿素含量高的青蒿植株，通過花藥培養(yǎng)培育成單倍體，然后采用染色體加倍劑使單倍體青蒿植株染色體恢復(fù)到正常水平進而培育成純合品系是青蒿育種的一個優(yōu)良方法，通過該方法可以在較短時間內(nèi)培育出青蒿素含量高的青蒿純合品系。然而，到目前為止，國內(nèi)外還沒有關(guān)于通過花藥培養(yǎng)培育青蒿單倍體植株的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前尚無培育青蒿單倍體植株方法的現(xiàn)狀，提供一種通過花藥培養(yǎng)培育青蒿單倍體植株的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種獲得青蒿單倍體植株的方法包括如下步驟(1)選取青蒿花藥中小孢子發(fā)育處于單核期的青蒿花蕾；(2)采集小孢子處于單核晚期的花蕾，消毒后將花藥分離出來接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)一段時間后繼續(xù)見光培養(yǎng)；(3)將步驟( 長出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至愈傷分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至分化出芽；(4)將分化出芽的健壯小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；
(5)將生根后的茁壯幼嫩青蒿苗移出培養(yǎng)灌，移栽入土 ；(6)對步驟( 獲得的花培植株進行倍性鑒定，篩選出單倍體青蒿植株。優(yōu)選地，步驟(1)所述小孢子發(fā)育時期為單核晚期，即單核靠邊期。優(yōu)選地，步驟⑵所述花藥接種密度為10 50枚/皿，更優(yōu)選地為30枚/皿。優(yōu)選地，步驟(2)所述黑暗培養(yǎng)為25°C下黑暗培養(yǎng)15 50天，更為優(yōu)選地，為 15 30天。優(yōu)選地，步驟( 所述見光培養(yǎng)的條件為溫度為25°C、光照強度為20001x、光照周期為16/8(光照/黑暗時間比)；所述見光培養(yǎng)的時間為5 15天，更為優(yōu)選地，為5 10天。優(yōu)選地，步驟⑵所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA，其中，6-BA(6-芐氨基嘌呤)濃度優(yōu)選為0. 5 1. 5mg/L,更優(yōu)選地為1. Omg/L ；NAA(萘乙酸)濃度優(yōu)選為0. 1
0.8mg/L，更優(yōu)選地為 0. 3mg/L0優(yōu)選地，步驟(3)所述愈傷分化培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA，其中，6-BA濃度優(yōu)選為
1.O 4. Omg/L,更優(yōu)選地為4. Omg/L ；NAA濃度優(yōu)選為0. 01 0. lmg/L,更優(yōu)選地為0. 05mg/ L0 優(yōu)選地，步驟(4)所述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA，其中，NAA濃度優(yōu)選為O 1. Omg/ L，更優(yōu)選地為0. 5mg/L。優(yōu)選地，步驟(6)所述倍性鑒定方法為流式細胞法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為首次實現(xiàn)了通過花藥培養(yǎng)培育出青蒿花培植株，并從其中鑒定出了單倍體青蒿苗，填補了青蒿單倍體育種領(lǐng)域的技術(shù)空白，為青蒿純系育種平臺的構(gòu)建以及以青蒿單倍體為材料的如單倍體轉(zhuǎn)基因技術(shù)等實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。


圖1為青蒿小孢子發(fā)育時期鑒定圖；其中，(a)為四分體時期小孢子；(b)為單核期小孢子；圖2為青蒿花培植株通過流式細胞術(shù)鑒定倍性的結(jié)果圖；其中，(a)為對照正常二倍體植株，(b)為檢測到的單倍體青蒿花培植株。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)條件。實施例1第一步、青蒿小孢子發(fā)育時期的鑒定當青蒿進入生殖生長期后，在短日照條件刺激下即進入開花周期。選取直徑在 1 2cm的花蕾，在解剖鏡下用醫(yī)用解剖鑷(產(chǎn)品編號WA3030，購于上海醫(yī)療器械有限公司)分離出花藥，置于載玻片上，用傳統(tǒng)壓片染色方法制片鏡檢，染色劑采用醋酸洋紅，鑒定出小孢子發(fā)育時期，選取發(fā)育處于單核晚期即單核靠邊期的青蒿花藥。鏡檢結(jié)果如圖1所示其中，(a)顯示小孢子發(fā)育處于四分體時期，在該時期，由同一個小孢子母細胞通過減數(shù)分裂形成的四個小孢子被共同的胼胝質(zhì)壁包圍在一起；(b)顯示小孢子發(fā)育處于單核期，在四分體時期的小孢子經(jīng)過一段時間的發(fā)育之后，包被在其外面的胼胝質(zhì)壁逐漸溶解， 四個小孢子從里面游離出來，即進入單核期，單核期小孢子的體積相比較之前的四分體時期迅速增大，并形成一定形狀和厚度的壁。第二步、青蒿花藥的分離接種通過鏡檢觀察后根據(jù)結(jié)果選取發(fā)育處于單核晚期的青蒿花蕾，采集后置于2. OmL 離心管，在超凈臺上完成分離和接種操作，包括如下步驟(1)將花藥分離和接種整個過程中用到的所有器械放入超凈臺紫外殺菌30min， 包括解剖鏡、醫(yī)用解剖鑷(產(chǎn)品編號WA3030，購于上海醫(yī)療器械有限公司)、針灸針(市售可得，規(guī)格為0. 25mm X 40mm)等。(2)用70%乙醇對花蕾進行外部消毒lmin，接著用15%次氯酸鈉對花蕾進行外部消毒lOmin，最后用滅菌水清洗花蕾5次。(3)將經(jīng)步驟⑵消毒過的花蕾置于解剖鏡下方，用解剖鑷分離出花蕾內(nèi)部的花。 青蒿有兩種花，包括排列于花蕾外輪的單性花(雌性花)和排列于內(nèi)部的數(shù)輪兩性花(包括雌蕊和雄蕊)。用解剖鑷繼續(xù)割裂分離出的兩性花，將其內(nèi)部的花藥剝離出來。(4)將分離出來的青蒿花藥用針灸針挑起接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種密度為每皿30枚左右。培養(yǎng)基配方為MS+1. Omg/L 6-BA+O. 3mg/L NAA，裝于90mm常規(guī)培養(yǎng)皿。第三步、愈傷誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)將第二步中接種過花藥后的培養(yǎng)皿置于25°C下黑暗培養(yǎng)20天，以誘導(dǎo)出愈傷，之后進行見光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C、光照強度為20001x、光照周期為16/8 (光照/黑暗時間比)，見光培養(yǎng)時間為7天。之后將白色稍泛綠色的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至愈傷分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。愈傷分化培養(yǎng)基裝于90mm常規(guī)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基配方為MS+4. 0mg/L6-BA+0. 05mg/L NAA，培養(yǎng)條件同愈傷誘導(dǎo)見光培養(yǎng)的條件。愈傷分化培養(yǎng)時間為25天。第四步、生根壯苗愈傷分化后，剪取茁壯嫩芽接種于生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基裝于150mL三角瓶，每瓶盛裝50mL，培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. 5mg/L NAA。生根培養(yǎng)20天后，將再生的花培植株移入珍珠巖煉苗3天。煉苗后將健康幼嫩的青蒿花培植株移栽入土?；ㄅ嘀仓暌圃匀胪梁笫┮猿Ｒ?guī)水分和養(yǎng)料，培養(yǎng)45天后，即可采用流式細胞術(shù)對花培植株進行倍性鑒定。第五步、花培植株倍性檢測本實施例采用流式細胞術(shù)對所得花培植株進行倍性鑒定，該方法快捷靈敏，已被廣泛應(yīng)用于植物的倍性鑒定。流式細胞術(shù)的檢測原理為當植株細胞的細胞核攜帶有熒光素標記物，并通過激光照射區(qū)時，將受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細胞核內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度與細胞核的DNA含量成正比。熒光信號經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號， 再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，最后即可通過計算機輸出結(jié)果判定被檢測細胞的DNA含量。流式細胞法的檢測方法為
(1)配制實驗所需溶液，包括MgSO4緩沖液、提取液A和提取液B。MgSO4 緩沖液0. 246g(IOmM)MgSO4 · 7H20+0. 370g(50mM)KC1+0. 120g(5mM) HEPES (準確稱取HEPES1. 1915g，加入ddH20定容至1L。過濾除菌，分裝后4°C保存)。以 ddH20 定容至 IOOmLdM pH 至 8. 0。提取液A :MgS04緩沖液中附加(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-30，貯藏于4°C 中備用；提取液B :MgS04 緩沖液附加 0. 40mg/mL 碘化丙錠(propidium iodide, PI)和 0. 04mg/mL RNase (DNase free)，現(xiàn)配現(xiàn)用。配制 DNase free 的 RNA 酶時，將 RNA 酶 A 溶于 IOmM Tris · HCl (pH 7. 5)、15mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的溶液，于 100°C 中加熱 15min，緩慢冷卻至室溫后分裝成小份，保存于-20°C冰箱中。(2)樣品制備剪取幼嫩青蒿葉片放入培養(yǎng)皿中，加入ImL的提取液A，在培養(yǎng)皿里用鋒利的刀片快速將其切碎，對照和花培植株均做一份。溶液用200目尼龍布過濾至1. 5mL離心管中，以 IOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液至0. ImL刻度處；再加入ImL提取液A于沉淀中，充分混勻，以IOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液至0. 1刻度處(重復(fù)三次)。加入500 μ L 提取液B，以錫箔紙包住離心管以避光保存，充分混勻后于37°C染色30min。⑶倍性檢測步驟( 染色后即可進行上樣檢測。將對照和花培植株樣本進行流式細胞儀檢測并通過與之連接的電腦軟件BD FACS Calibur Software Package分析檢測結(jié)果，繪制成圖。結(jié)果如圖2所示其中，(a)為對照正常二倍體植株流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖，圖中結(jié)果顯示在200通道處有單峰；(b)為單倍體花培植株流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖，圖中結(jié)果顯示在 100通道處有單峰。結(jié)果顯示，本實施例的方法通過花藥培養(yǎng)獲得了青蒿單倍體植株。實施例2本實施例同實施例1，所不同之處在于第二步的步驟中，所述接種密度為10枚/皿；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA ；第三步中，所述接種過花藥后的培養(yǎng)皿是置于25°C下黑暗培養(yǎng)15天；所述見光培養(yǎng)時間為5天；所述愈傷分化培養(yǎng)基配方為MS+1. 0mg/L6-BA+0. 0lmg/L NAA。第四步中，所述生根培養(yǎng)基配方為1/2MS。實施例3本實施例同實施例1，所不同之處在于第二步的步驟中，所述接種密度為20枚/皿；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為 MS+0. 8mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；第三步中，所述接種過花藥后的培養(yǎng)皿是置于25°C下黑暗培養(yǎng)30天；所述見光培養(yǎng)時間為10天；所述愈傷分化培養(yǎng)基配方為MS+2. 0mg/L6-BA+0. 08mg/L NAA。第四步中，所述生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. 8mg/L NAA。實施例4本實施例同實施例1，所不同之處在于第二步的步驟中，所述接種密度為50枚/皿；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+1. 5mg/L6-BA+0. 8mg/L NAA ；第三步中，所述接種過花藥后的培養(yǎng)皿是置于25°C下黑暗培養(yǎng)50天；所述見光培養(yǎng)時間為15天；所述愈傷分化培養(yǎng)基配方為MS+3. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA。第四步中，所述生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+1. Omg/L NAA。綜上所述，本發(fā)明首次實現(xiàn)了通過花藥培養(yǎng)培育出青蒿花培植株，并從其中鑒定出了單倍體青蒿苗，填補了青蒿單倍體育種領(lǐng)域的技術(shù)空白，為青蒿純系育種平臺的構(gòu)建以及以青蒿單倍體為材料的如單倍體轉(zhuǎn)基因技術(shù)等實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)選取青蒿花藥中小孢子發(fā)育處于單核期的青蒿花蕾；(2)采集小孢子發(fā)育處于單核晚期的花蕾，消毒后將花藥分離出來接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)，之后見光培養(yǎng)；(3)將步驟( 長出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至愈傷分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至分化出芽；(4)將分化出芽的健壯小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(5)將生根后的茁壯幼嫩青蒿苗移出培養(yǎng)灌，移栽入土；(6)對步驟( 獲得的花培植株進行倍性鑒定，篩選出單倍體青蒿植株。
2.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(1)所述的小孢子發(fā)育時期為單核晚期，即單核靠邊期。
3.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(2)所述花藥接種密度為10 50枚/皿。
4.如權(quán)利要求3所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，所述花藥接種密度為30枚/皿。
5.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(2)所述黑暗培養(yǎng)具體為在25°C下黑暗培養(yǎng)15 50天。
6.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(2)所述見光培養(yǎng)的條件為溫度為25°C、光照強度為20001x、光照周期為光照/黑暗時間比是16/8 ；所述見光培養(yǎng)的時間為5 15天。
7.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(2)所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA，其中6-BA濃度為0. 5 1. 5mg/L, NAA濃度為0. 1 0. 8mg/L。
8.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(3)所述愈傷分化培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA，其中6-BA濃度為1. 0 4. Omg/L, NAA濃度為0. 01 0. lmg/L。
9.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(4)所述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA，其中NAA濃度為0 1. Omg/L。
10.如權(quán)利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特征在于，步驟(6)所述倍性鑒定方法為流式細胞法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得青蒿單倍體植株的方法，該方法通過分離小孢子發(fā)育時期處于單核晚期的青蒿花藥，依次通過愈傷誘導(dǎo)、愈傷分化和生根培養(yǎng)獲得青蒿花培植株。之后通過流式細胞術(shù)檢測所獲得的青蒿花培植株的遺傳物質(zhì)倍性，結(jié)果顯示通過本發(fā)明所述方法可以獲得單倍體青蒿植株。本發(fā)明填補了青蒿單倍體育種領(lǐng)域的技術(shù)空白，為青蒿純系育種平臺的構(gòu)建和以單倍體青蒿為材料的如單倍體轉(zhuǎn)基因技術(shù)等實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK102524066SQ20111043080
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者吳韶龑, 唐克軒, 沈乾, 王濤, 陸續(xù), 陳韻斐 申請人:上海交通大學(xué)