專利名稱：一種藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是藥品的輔料，也涉及生物制品的玻璃化凍存技術(shù)，具體涉及一種藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，通過在藥用細(xì)胞制品中添加聚乙二醇、 1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉等凍存保護(hù)劑實(shí)現(xiàn)藥用細(xì)胞制品的玻璃化凍存，提高解凍后的復(fù)蘇率，并且安全無毒，實(shí)現(xiàn)藥用細(xì)胞制品解凍后直接臨床使用，此外該輔料還具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)免疫力、增強(qiáng)細(xì)胞治療效果的功能。
背景技術(shù)：
細(xì)胞治療又稱活細(xì)胞治療，是指用活細(xì)胞修復(fù)病變或損傷的組織。細(xì)胞治療中使用的細(xì)胞可以有多種來源，根據(jù)對(duì)國(guó)家藥監(jiān)局網(wǎng)站的檢索，目前我國(guó)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的細(xì)胞治療產(chǎn)品有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血巨核系祖細(xì)胞、臍帶血紅系祖細(xì)胞、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)等；根據(jù)衛(wèi)生部2009年頒布的《首批允許臨床應(yīng)用的第三類醫(yī)療技術(shù)目錄》，細(xì)胞移植治療技術(shù)(干細(xì)胞除外)、造血干細(xì)胞治療技術(shù)已經(jīng)被允許應(yīng)用于臨床。此外國(guó)內(nèi)外還有神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞作為藥物或醫(yī)療技術(shù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)或動(dòng)物試驗(yàn)。由于細(xì)胞治療要使用活細(xì)胞，藥用細(xì)胞制品在儲(chǔ)存過程中必須保持細(xì)胞的活性。 傳統(tǒng)的長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法是在細(xì)胞制品中加入10%左右的DMSO作為低溫保護(hù)劑，然后凍存于-196°C液氮或_80°C超低溫冰箱中。然而DMSO具有很高的毒副作用，通常使接受移植的個(gè)體產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，對(duì)心血管、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)以及腎臟等也會(huì)產(chǎn)生副作用。使用DMSO作為凍存劑時(shí)，在細(xì)胞解凍復(fù)蘇后進(jìn)行一段時(shí)間的馴化培養(yǎng)后再進(jìn)行細(xì)胞移植才比較安全。因此尋找一種毒副作用小、細(xì)胞解凍后能夠直接移植的凍存保護(hù)劑非常重要。玻璃化方法是在完全玻璃化狀態(tài)下保存生物材料的一種方法。玻璃化是指液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)的固化過程，玻璃態(tài)固體能保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，可以避免因結(jié)冰對(duì)生物材料造成的物理性損傷。玻璃化方法操作簡(jiǎn)單快速，對(duì)細(xì)胞、組織損傷小，是一種非常有前景的生物材料的長(zhǎng)期保存方法。本發(fā)明提供了一種新的藥用級(jí)細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，包括聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉等成分。該細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料可以有效形成細(xì)胞或組織的低溫玻璃化長(zhǎng)期凍存效果，并且使用該輔料凍存的細(xì)胞注射液解凍后能夠直接移植，具有安全、方便、快捷等特點(diǎn)，此外還具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)免疫力、 增強(qiáng)細(xì)胞治療效果的功能，更適于細(xì)胞治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)細(xì)胞治療的特殊需求，提供一種藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，使細(xì)胞治療更加安全、方便、快捷。本發(fā)明涉及一種藥用的生物組織樣本，例如，細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。在具體的實(shí)施方案中，所述聚乙二醇在所述
3生物組織樣本，例如細(xì)胞注射液中的終濃度為5-100g/L、25-100g/L、50-100g/L、75-100g/ L、80-100g/L、90-100g/L;所述1，2-丙二醇在所述生物組織樣本，例如細(xì)胞注射液中的終濃度為 50-400g/L、100-400g/L、150-400g/L、200-400g/L、250-400g/L、300-400g/L ；所述白蛋白在所述生物組織樣本，例如細(xì)胞注射液中的終濃度為10-100g/L、30-100g/L、 50-100g/L、70-100g/L、80-100g/L、90-100g/L ；所述氯化鈉在所述生物組織樣本，例如細(xì)胞注射液中的終濃度為 8. 5-9. 5g/L、8. 6-9. 4g/L、8. 7-9. 3g/L、8. 8-9. 2g/L、8. 9-9. lg/L、9g/ L。以上所列聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分的終濃度范圍可以任意組合，配制成本發(fā)明的藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇、1， 2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分在所述細(xì)胞注射液中的終濃度為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50-400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8.5_9.5g/L。優(yōu)選，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉在所述細(xì)胞注射液中的終濃度為聚乙二醇，50_100g/L，1,2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，氯化鈉，8.5_9.5g/L。更優(yōu)選，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉在所述細(xì)胞注射液中的終濃度為聚乙二醇，80_100g/L，1,2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化鈉，9g/L。配制本發(fā)明的凍存保護(hù)輔料所采用的所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白、氯化鈉優(yōu)選均為藥用級(jí)產(chǎn)品；所述的白蛋白優(yōu)選是人血白蛋白或稱為人血清白蛋白；所述的聚乙二醇優(yōu)選是分子量為400的聚乙二醇(PEG400)。本發(fā)明的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料可以用作細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)劑，還可以用做生物組織樣本玻璃化凍存的保護(hù)劑。本發(fā)明涉及一種生物組織樣本凍存保護(hù)劑，含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度分別為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50_400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8.5_9.5g/L。優(yōu)選，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度為聚乙二醇，50_100g/L，1，2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，
氯化鈉，8.5_9.5g/L。更優(yōu)選，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度為聚乙二醇，80_100g/L，1，2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化鈉，9g/L。在以上實(shí)施方案中，所述的白蛋白是人血白蛋白；所述的聚乙二醇是分子量為 400的聚乙二醇(PEG400)。以上所述的生物組織樣本優(yōu)選為用于細(xì)胞移植的新鮮分離后的細(xì)胞懸液或凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液等等。術(shù)語“細(xì)胞治療”或稱為“活細(xì)胞治療”，是指將活性細(xì)胞注入體內(nèi)，刺激退化、衰老、損傷細(xì)胞，促進(jìn)其更新、修復(fù)，從而恢復(fù)器官功能。根據(jù)尼漢斯醫(yī)生證明的理論，這些細(xì)胞從注射的位置開始循環(huán)，甚至它們識(shí)別出與其來源器官相似的器官，并在其上聚集，例如，肝臟細(xì)胞進(jìn)入肝臟、性細(xì)胞移至性器官、心臟細(xì)胞進(jìn)入心臟等等。目前國(guó)內(nèi)外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血巨核系祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞作為藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或動(dòng)物試驗(yàn)。在活細(xì)胞的臨床應(yīng)用中，保持細(xì)胞的活性是至關(guān)重要的。本發(fā)明的細(xì)胞注射液凍存保護(hù)輔料能夠使復(fù)溶的細(xì)胞注射液在90小時(shí)和30天后活細(xì)胞的數(shù)量仍保持在85%以上。同時(shí)，本發(fā)明的凍存保護(hù)輔料通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明也是安全的?！安ＡЩ眱龃媸侵冈诮禍剡^程中，不產(chǎn)生冰晶，而使溶液固化的過程。它與常見的液體變晶體或部分結(jié)晶的凍結(jié)過程不同。在本發(fā)明的輔料中，聚乙二醇和白蛋白起非滲透性凍存保護(hù)作用，能夠深入細(xì)胞內(nèi)部，具有降低冰點(diǎn)、減少冰晶形成、稀釋溶液中電解質(zhì)的濃度、減少溶質(zhì)損傷、平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、減輕細(xì)胞縮水程度等作用。1，2_丙二醇和氯化鈉起滲透性凍存保護(hù)作用。上述成分聯(lián)合使用，產(chǎn)生了顯著的協(xié)同效果，迫使某些熱力學(xué)參數(shù)發(fā)生了改變，比如玻璃化溫度升高、玻璃化所需濃度降低，提高了保存效果，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞注射液的低溫玻璃化長(zhǎng)期凍存。本發(fā)明上述輔料中的各成分均是常用的化學(xué)試劑或生物制品，其中聚乙二醇可購(gòu)自青島天力源生物科技有限公司，1，2_丙二醇可購(gòu)自錦化化工(集團(tuán))有限責(zé)任公司，白蛋白可購(gòu)自上海生物制品所，氯化鈉可以生理鹽水的形式購(gòu)自吉林都邦藥業(yè)股份有限公司。
具體實(shí)施例方式(1)配置輔料將聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉各輔料成分按照前述濃度添加到水中溶解，或者將聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白各輔料成分按照前述濃度添加到生理鹽水中溶解，制成輔料溶液；(2)制備注射液將培養(yǎng)液中的細(xì)胞放到離心管中離心，棄上清，將步驟(1)制備的輔料溶液添加到離心管中，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞在溶液中的濃度達(dá)到1. OX 10~6個(gè)細(xì)胞/ ml，制成藥用細(xì)胞注射液；(3)凍存將步驟(2)制備的藥用細(xì)胞注射液按照“4°C 1小時(shí)一-200C 1小時(shí) —-700C 10小時(shí)一液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存”的步驟儲(chǔ)存于液氮中；(4)復(fù)溶使用前，將步驟(3)中儲(chǔ)存的藥用細(xì)胞注射液從液氮中取出，放置于
535°C中復(fù)溶，然后用于細(xì)胞移植。實(shí)施例1 (1)按照下面的配方配置IOOml輔料溶液
權(quán)利要求
1.一種藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，含有聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其中所述成分在所述細(xì)胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L ； 1，2-丙二醇，50-400g/L; 白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8. 5-9. 5g/L。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其中所述成分在所述細(xì)胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇， 50-100g/L， 1,2-丙二醇，100-400g/L， 白蛋白，50-100g/L，氯化鈉，8. 5-9. 5g/L。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其中所述成分在所述細(xì)胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇， 80-100g/L， 1,2-丙二醇，200-400g/L， 白蛋白，80-100g/L，氯化鈉，9g/L。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其中所述的白蛋白是人血白蛋白。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其中所述的聚乙二醇是分子量為400的聚乙二醇(PEG400)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其還可以用做生物組織樣本玻璃化凍存的保護(hù)劑。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，其為生物組織樣本凍存保護(hù)劑。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的凍存保護(hù)輔料在細(xì)胞注射液凍存或生物組織樣本玻璃化凍存方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥用細(xì)胞注射液的凍存保護(hù)輔料，包括一定含量的聚乙二醇、丙二醇、白蛋白、氯化鈉。該輔料還可以用作生物組織樣本玻璃化凍存的保護(hù)劑。該輔料在藥用細(xì)胞注射液凍存、復(fù)蘇過程中能夠減輕對(duì)細(xì)胞的傷害、維持細(xì)胞活性，含有該輔料的藥用細(xì)胞注射液可實(shí)現(xiàn)低溫玻璃化長(zhǎng)期凍存，解凍后可直接用于細(xì)胞移植，具有使用安全、方便、快捷等特點(diǎn)。此外，該輔料還具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)免疫力、增強(qiáng)細(xì)胞治療效果的功能，更適于細(xì)胞治療。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102273438SQ20111023198
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者劉軍, 楊立敏, 金宜強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司