專利名稱：蝗蟲微孢子蟲株系及其在防治蝗蟲中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蝗蟲微孢子蟲株系及其在防治蝗蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝗蟲災(zāi)害與水、旱災(zāi)常交替發(fā)生，一直是嚴(yán)重威脅我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、影響人民生活的三大自然災(zāi)害。我國已記錄的蝗蟲600多種，其中對農(nóng)、林、牧業(yè)可造成危害的約60余種。目前防治蝗蟲的方法主要是采用化學(xué)農(nóng)藥防治，盡管化學(xué)防治可以迅速壓低蝗蟲的蟲口密度，但是往往造成污染環(huán)境、殺傷大量有益動物、人畜中毒和害蟲產(chǎn)生抗藥性等不良后果等。生物農(nóng)藥治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不殺傷天敵、對環(huán)境友好、對人畜安全，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。已有關(guān)于利用綠僵菌防治蝗蟲的技術(shù)，但是因其生產(chǎn)成本高、保存期短、使用的環(huán)境條件要求苛刻、對有些生物不安全等，而限制了使用范圍。蝗蟲微孢子蟲是蝗蟲的專性寄生原生動物，只對蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性，因此十分安全。而且該病原物在田間使用過程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成本低，因此很有競爭性。但是，蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱，因此提高蝗蟲微孢子蟲的毒力十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蝗蟲微孢子蟲株系及其在防治蝗蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的將蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae)，命名為AL2008L-04株系，是從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到的，已于2011年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3 號)，菌種保藏號為 CGMCC No. 4901?；认x微孢子蟲(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系 CGMCC No. 4901 簡稱 AL2008L-04 株系。本發(fā)明還提供了一種制備蝗蟲防治劑的活性成分的方法，包括如下步驟(1)將涂有所述AL2008L-04株系的孢子液的植物葉片飼喂蝗蝻
(2)改用正常植物葉片飼喂直至死亡；(3)取死亡蟲體中的所述AL2008L-04株系的孢子，即為蝗蟲防治劑的活性成分。步驟(1)中，所述孢子液與所述植物葉片的質(zhì)量比具體可為1 1。步驟(1)中，所述孢子液的濃度具體可為IXlO6孢子/毫升。步驟(1)中，用所述植物葉片飼喂所述蝗蝻的時間具體可為2天。步驟(1)中，用所述植物葉片飼喂所述蝗蝻的飼喂條件具體可為25-32°C，相對濕度60-70%，光照時間16小時/天(光源為白熾燈)，每天飼喂2次。步驟(1)和/或步驟O)中，所述植物具體可為玉米和/或小麥。步驟(3)中，具體可通過如下方法取所述死亡蟲體中的所述AL2008L-04株系的孢子將所述死亡蟲體研磨、再用120目的網(wǎng)篩過濾；將所有過濾得到的組織液用等體積的水 (最好為蒸餾水)稀釋后，進(jìn)行如下差速離心500-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘取上清，將上
3清液3000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘取沉淀，即為所述AL2008L-04株系的孢子。所述蝗蝻具體可為4齡蝗蝻。所述4齡蝗蝻具體通過如下方法得到將蝗蟲(如東亞飛蝗)的卵在條件下孵化，在，相對濕度60-70%條件下每天飼喂植物葉片，飼養(yǎng)至4齡蝗蝻。所述植物具體可為玉米和/或小麥。以上任一所述方法制備得到的活性成分也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護含有所述活性成分的蝗蟲防治劑。每毫克蝗蟲防治劑中具體可含有 IO7個所述AL2008L-04株系的孢子。所述蝗蟲防治劑具體可由所述活性成分、吐溫_80、蔗糖和水組成；所述蝗蟲防治劑中，所述AL2008L-04株系的孢子的濃度具體可為IO7孢子/毫升，吐溫-80的質(zhì)量百分含量具體可為4%，蔗糖的質(zhì)量百分含量具體可為3%。所述蝗蟲防治劑在應(yīng)用時采用噴霧，噴霧可以一次也可多次。本發(fā)明提供的蝗蟲防治劑可用于防治草原蝗蟲、飛蝗等多種蝗蟲。該產(chǎn)品屬于生物農(nóng)藥，對環(huán)境和人、畜、禽無毒害作用，對天敵安全，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明對于提高我國蝗蟲防治技術(shù)水平具有重要意義。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、蝗蟲微孢子蟲AL2008-01株系的獲得將田間采集的患病的東亞飛蝗，研磨、過濾、鏡檢，之后離心純化，從蟲體分離得到不同株系的野生蝗蟲微孢子蟲。將各個野生蝗蟲微孢子蟲株系以一系列的濃度涂抹在玉米葉片上，之后喂飼東亞飛蝗4齡蝗蝻2天，收獲死亡較早的蟲體，經(jīng)過研磨、過濾、離心等， 得到純化的蝗蟲微孢子蟲。連續(xù)篩選30代，得到蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系。在光學(xué)顯微鏡GOO倍)可見AL2008L-04株系的孢子呈卵圓形，大小為 (6. 13 士 1. 37) μπιΧ (3. 17 士 0. 53) μ m,比已有的株系(5. 40 士 0. 50) ymX (3. 11 士 0. 37) μπι略大。2011 年5月 23 日將蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae)AL2008L-04株系保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo. 4901。 蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系 CGMCC No. 4901 簡稱 AL2008L-04株系。實施例2、AL2008-01株系的致病性鑒定實施例中的玉米葉片均可用小麥葉片代替。一、AL2008-01株系的孢子的制備1、將東亞飛幢(Locusta migratoria manilensis)的卵在條件下孵化，在 ^-32°C，相對濕度60-70%條件下每天飼喂新鮮玉米葉片，飼養(yǎng)至4齡蝗蝻。2、將AL2008L-04株系的孢子液(IX IO6孢子/毫升)涂抹在新鮮玉米葉片上，玉米葉片與孢子液的質(zhì)量比為1 1，用于飼喂4齡蝗蝻，連續(xù)飼喂2天，之后用新鮮玉米葉正
4常飼養(yǎng)直至蝗蟲死亡；飼養(yǎng)條件溫度保持在25-32°C，相對濕度保持在60%左右，光照時間16小時/天(光源為白熾燈)，每天飼喂玉米葉片2次。3、將死亡后的蝗蟲蟲體研磨、再用120目的網(wǎng)篩過濾；將所有過濾得到的組織液用等體積的蒸餾水稀釋后，進(jìn)行如下差速離心第一次1000轉(zhuǎn)/分鐘(500-1000轉(zhuǎn)/分鐘均可)離心15分鐘，取上清；之后再將上清液3000轉(zhuǎn)/分鐘的離心30分鐘取沉淀)，即為 AL2008L-04株系的孢子。二、AL2008-01株系的致病性鑒定( 一 )AL2008L-04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的LD501、將東亞飛蝗的卵在條件下孵化，在^_32°C，相對濕度60_70%條件下每天飼喂新鮮玉米葉(玉米葉也可用小麥葉代替)，飼養(yǎng)至3齡蝗蝻。2、將不同濃度的AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鮮玉米葉片上，玉米葉片與孢子液的質(zhì)量比為1 1，用于飼喂3齡蝗蝻，連續(xù)飼喂2天，之后用新鮮玉米葉正常飼養(yǎng) 26天，統(tǒng)計死亡率，計算AL2008L-04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的LD5tl (半數(shù)致死量)；飼養(yǎng)條件溫度保持在25-32°C，相對濕度保持在60%左右，光照時間16小時/天，每天飼喂玉米葉2次。AL2008L-04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的LD5tl (半數(shù)致死量)為2. 5 X IO6個孢子/ 克3齡蝗蝻。( 二)AL2008L_04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的LT501、將東亞飛蝗的卵在條件下孵化，在^_32°C，相對濕度60_70%條件下每天飼喂新鮮玉米葉(玉米葉也可用小麥葉代替)，飼養(yǎng)至3齡蝗蝻。2、將AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鮮玉米葉片上，玉米葉片與孢子液的質(zhì)量比為1 1，用于飼喂3齡蝗蝻，連續(xù)飼喂2天，飼喂劑量為5X106個孢子/克3齡蝗蝻； 之后用新鮮玉米葉正常飼養(yǎng)直至蝗蟲死亡，統(tǒng)計死亡率，計算AL2008L-04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的LT5tl (半數(shù)致死時間)；飼養(yǎng)條件溫度保持在25-32°C，相對濕度保持在60%左右，光照時間16小時/天，每天飼喂玉米葉2次。在5X IO6個孢子/克3齡蝗蝻的劑量下AL2008L-04株系對3齡東亞飛蝗蝗蝻的 LT5tl (半數(shù)致死時間)為17天。步驟(一)和步驟(二)的結(jié)果表明，AL2008-01株系具有良好的致病力。實施例3、制劑的制備及其應(yīng)用一、用AL2008-01株系制備制劑用實施例2的步驟一制備的AL2008L-04株系的孢子、吐溫_80、蔗糖和水制備可溶性懸浮劑，AL2008L-04株系的孢子的濃度為IO7孢子/毫升，吐溫-80的質(zhì)量百分含量為 4%，蔗糖的質(zhì)量百分含量為3%。二、制劑的應(yīng)用分別在河北、山東、河南、安徽、海南、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海、遼寧、廣西、廣東、 山西、陜西進(jìn)行大田試驗，方法如下將步驟一制備的可溶性懸浮劑在蝗蟲處于2齡盛發(fā)期時進(jìn)行大田噴霧(設(shè)置至少三個重復(fù)，每個重復(fù)的面積至少為1公頃大田)，每公頃使用3000毫升制劑，作為實驗組； 設(shè)置不采用制劑進(jìn)行噴霧的大田作為平行對照(設(shè)置至少三個重復(fù)，每個重復(fù)至少為1公頃大田)，即對照組；噴霧后第20天統(tǒng)計進(jìn)行噴霧的實驗組大田和對照組大田中的蝗蟲數(shù)量，實驗組大田和對照組大田各設(shè)置30個調(diào)查樣點，每個調(diào)查樣點大小為1平方米，實驗組和對照組的蝗蟲數(shù)量均取30個調(diào)查樣點的平均值?；认x的死亡率=(對照組的蝗蟲數(shù)量-實驗組的蝗蟲數(shù)量)/對照組的蝗蟲數(shù)量*100%。結(jié)果見表1。表1各個地域的大田試驗蝗蟲的死亡率
權(quán)利要求
1.蝗蟲微孢子蟲(Antonosporalocustae) AL2008L-04株系，它的保藏編號為CGMCC No.4901。
2.制備蝗蟲防治劑的活性成分的方法，包括如下步驟(1)將涂有權(quán)利要求1所述蝗蟲微孢子蟲AL2008L-04株系的孢子液的植物葉片飼喂蝗蝻；(2)改用正常植物葉片飼喂直至死亡；(3)取死亡蟲體中的蝗蟲微孢子蟲AL2008L-04株系的孢子，即為蝗蟲防治劑的活性成分。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述孢子液與所述植物葉片的質(zhì)量比為1 1 ；所述孢子液的濃度為IXIO6孢子/毫升。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于步驟(1)中，用所述植物葉片飼喂所述蝗蝻的時間為2天；用所述植物葉片飼喂所述蝗蝻的飼喂條件為25-32°C，相對濕度 60-70 %，光照時間16小時/天，每天飼喂2次。
5.如權(quán)利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于步驟⑴和/或步驟(2)中，所述植物為玉米和/或小麥。
6.如權(quán)利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于所述蝗蝻為4齡蝗蝻；所述4 齡蝗蝻優(yōu)選通過如下方法得到將蝗蟲的卵在條件下孵化，在^_32°C，相對濕度 60-70 %條件下每天飼喂植物葉片，飼養(yǎng)至4齡蝗蝻。
7.權(quán)利要求2至6中任一所述方法制備得到的活性成分。
8.含有權(quán)利要求7所述的活性成分的蝗蟲防治劑。
9.如權(quán)利要求8所述的蝗蟲防治劑，其特征在于每毫克蝗蟲防治劑中含有IO7個權(quán)利要求1所述蝗蟲微孢子蟲AL2008L-04株系的孢子。
10.如權(quán)利要求9所述的蝗蟲防治劑，其特征在于所述蝗蟲防治劑由權(quán)利要求7所述活性成分、吐溫-80、蔗糖和水組成，AL2008L-04株系的孢子的濃度為IO7孢子/毫升，吐溫-80的質(zhì)量百分含量為4%，蔗糖的質(zhì)量百分含量為3%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝗蟲微孢子蟲株系及其在防治蝗蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的將蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae)，命名為AL2008L-04株系，是從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到的，已于2011年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，菌種保藏號為CGMCC No.4901?；认x微孢子蟲(Antonospora locustae)AL2008L-04株系CGMCC No.4901簡稱AL2008L-04株系。本發(fā)明提供的蝗蟲防治劑可用于防治草原蝗蟲、飛蝗等多種蝗蟲。該產(chǎn)品屬于生物農(nóng)藥，對環(huán)境和人、畜、禽無毒害作用，對天敵安全，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明對于提高我國蝗蟲防治技術(shù)水平具有重要意義。
文檔編號A01P7/04GK102250772SQ201110174318
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者張龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)