專利名稱：一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的方法，特別是一種雙關鍵酶基因共轉化代謝工程策略提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的方法。
背景技術：
喜樹堿(Camptothecin，CPT)是最早從中國特有的喜樹(Camptotheca acuminata)中提取出來的一種具有顯著抗腫瘤活性的生物堿?，F(xiàn)有多種喜樹堿類藥物如依立替康(Irinotecan)和拓撲替康(Topotecan)獲得美國FDA(1992)認證，在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、直腸癌及白血病等多種惡性腫瘤，全球市場需求十分巨大。目前世界上喜樹堿類藥物的生產(chǎn)主要是從喜樹等植株中提取，然而由于喜樹天然資源數(shù)量有限，生長十分緩慢，喜樹堿及其類似物在植物體內含量又非常低，且提取環(huán)節(jié)多、費時費力，所以從天然喜樹中提取喜樹堿的方法已遠遠不能滿足人們對喜樹堿日益增長的需求。多年來，國內外學者圍繞著擴大喜樹堿藥源問題進行了諸多領域的研究如化學全合成，半合成及細胞培養(yǎng)等，并取得了一定的進展。喜樹堿的化學全合成雖然已經(jīng)成功，但因成本太高、產(chǎn)量太低、周期太長且易造成環(huán)境污染等因素而限制了其商業(yè)化生產(chǎn)；半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一，但其前體的提取分離仍然依賴于天然資源的供應；細胞懸浮培養(yǎng)則存在喜樹堿含量低微及穩(wěn)定性較差等問題同樣難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)(Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技術將喜樹堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入產(chǎn)喜樹堿的資源植物中，繼而獲得轉基因的發(fā)根系或再生植株等，并進行大規(guī)模的培養(yǎng)是實現(xiàn)從根本上提高喜樹堿含量的最佳途徑之一(Lorence and Nessler 2004，Lu et al 2008)。深入研究喜樹堿生物合成的代謝途徑及其分子調控是利用基因工程技術提高喜樹堿產(chǎn)量的前提和基礎。喜樹堿的生物合成來自于萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids, TIAs) (Lorence and Nessler2004)。由莽草酸途徑來的色胺(Tryptamine)與由5-磷酸脫氧木酮糖(DXP)途徑(或甲羥戊酸MVA途徑)經(jīng)多步反應生成的裂環(huán)馬錢子苷(Secologanin)，在異胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase, STR)催化下形成吲哚生物堿的共同前體異胡豆苷(Strictosidine，也稱次番木鱉苷)，再經(jīng)過幾步酶促反應后最終生成喜樹堿和10-羥基喜樹堿。大量研究表明，異胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脫羧酶 (Tryptophan decarboxylase，TDC)，香葉醇-10-脫氫酶即櫳牛兒醇-10-羥化酶(Geraniol 10-hydroxylase, GlOH)及 1_ 脫氧木酮糖 _5_ 磷酸合成酶(DXS，I-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase)等關鍵酶在包括喜樹堿在內的TIAs的生物合成中具有重要作用 (Canel et al 1998 ；De Luca et al 1989 ；Lopez-Meyer 1997 ；Yamazaki et al 2003 ； McKnight et al 1990 ；Kutchan 1989 ；Yamazaki et al 2003 ；Lu et al 2008)。采用基因工程手段，將上述的兩個關鍵酶基因STR和GlOH共轉化喜樹，將有可能打破喜樹堿生物合成途徑的瓶頸效應，獲得喜樹堿高產(chǎn)的喜樹毛狀根或植株，為商業(yè)化生產(chǎn)喜樹堿和羥基喜樹堿提供新型優(yōu)質藥源。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)技術中的不足，提供一種有效提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的方法。本發(fā)明還提供了實現(xiàn)上述方法的重組載體。本發(fā)明利用已克隆的長春花CrSTR和CrGlOH基因，構建含所述DNA分子的植物雙價表達載體，以發(fā)根農桿菌(如C58C1等)為介導，將異胡豆苷合成酶CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶CrGlOH基因同時導入喜樹(如下胚軸組織)中并再生出毛狀根；PCR和熒光定量PCR檢測目的基因CrSTR和CrGlOH的整合和表達情況，高效液相色譜測定喜樹轉基因毛狀根中喜樹堿含量。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，一種用于提高喜樹堿含量的重組載體，含有異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因。一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，包括如下步驟(1)將異胡豆苷合成酶基因(CrSTR 基因，SEQ ID NO. 1，GenBank :Χ53602· 1)和香葉醇-10-脫氫酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID NO. 2，GenBank :AJ251269. 1)插入植物表達載體，構建重組載體；根據(jù)從NCBI獲得的CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列設計引物，以長春花幼苗 RNA為模板PCR獲得CrSTR和CrGlOH基因片段；植物表達載體可選用pCAMBIA質?；騪BI質粒，尤其是pCAMBIA1304質粒；(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉入發(fā)根農桿菌，構建含有重組載體的發(fā)根農桿菌；發(fā)根農桿菌可選用發(fā)根農桿菌菌株C58C1、發(fā)根農桿菌菌株A4或發(fā)根農桿菌菌株 L BA9402 ；(3)利用所構建的含有重組載體的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化喜樹，優(yōu)選為喜樹下胚軸，獲得毛狀根；(4)檢測步驟(3)毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH，取篩選結果為陽性的轉基因毛狀根克?。粰z測方法為PCR 及 Southern blotting 檢測。PCR陽性的轉基因毛狀根克隆進行Southern blot檢測，證明目的基因CrSTR和 CrGlOH已整合到喜樹毛狀根基因組中。熒光定量PCR測定喜樹轉基因毛狀根中CrSTR和CrGlOH基因的相對表達量；并用高效液相色譜法測定喜樹轉基因毛狀根中喜樹堿含量，進一步篩選喜樹堿和羥基喜樹堿含量顯著提高的喜樹轉基因毛狀根株系。所述的PCR檢測中，分別在植物表達載體上啟動插入基因(CrSTR，CrGlOH)表達的組成型表達啟動子CaMV35S的內部及插入基因的內部設計上游及下游特異性引物進行DNA 的PCR擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉基因毛狀根株系。所述的熒光定量PCR檢測CrSTR和CrGlOH基因的表達情況，具體方法為對經(jīng)PCR 鑒定為陽性的毛狀根克隆進行總RNA的提取并反轉成cDNA第一條鏈，分別設計插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物，進行熒光定量PCR擴增，用相對定量法分析CrSTR和CrGlOH基因的相對表達量。本發(fā)明的雙關鍵酶基因共轉化策略提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，采用基因工程方法，將雙關鍵酶基因(CrSTR，CrGlOH)導入喜樹下胚軸中，獲得了高產(chǎn)喜樹堿的喜樹毛狀根株系。共轉CrSTR及CrGlOH基因的毛狀根中所檢測的喜樹堿和羥基喜樹堿含量相比于對照組顯著提高，平均含量為4. 95mg/g和0. 46mg/g，是對照組毛狀根(1. 03mg/g和 0. 21mg/g Dff)的 4. 8 倍和 2. 2 倍。本發(fā)明應用一些常規(guī)生物學實驗方法如載體構建、遺傳轉化、分子檢測、熒光定量 PCR分析、喜樹堿提取及含量測定等，建立了一種有效提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，為喜樹毛狀根商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新型優(yōu)質藥源。但目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的雙關鍵酶基因共轉化策略提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的相關報道。因此，本發(fā)明在實際解決喜樹堿藥源緊缺性的問題上具有十分重要的意義。


圖1為實施例3轉基因毛狀根中目的基因glOh㈧和str⑶基因的PCR檢測圖， 其中，M :DL2000分子大小標記；PC 質粒(陽性對照)；NC 空載體轉化得毛狀根(陰性對照)。阿拉伯數(shù)字代表不同的轉基因毛狀根無性系。圖2為熒光定量PCR檢測轉基因喜樹毛狀根中CrSTR和CrGlOH基因的表達
具體實施例方式下面結合具體實施例詳細闡述本發(fā)明。應理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建議的條件。實施例1長春花CrSTR及CrGlOH基因編碼序列的獲得1.1.長春花總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit從長春花幼苗中提取總 RNA(提取步驟參照試劑盒內的說明書)。用于提取總RNA的長春花幼苗的鮮重量為0. Ig 左右，在提取過程中樣品中的DNA已用DNase工作液清除。將提取的RNA在分光光度計上測定相關的吸光值，計算所提取RNA的純度及濃度。根據(jù)不同RNA樣品的濃度通過計算后， 分別以0.5yg RNA為起始量，用反轉錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成(操作步驟參照Promega公司提供的相關說明書)。1. 2. CrSTR和CrGlOH編碼序列特異引物的設計及目的基因片段的獲得根據(jù)從NCBI獲得的所述CrSTR基因的編碼序列(SEQ ID NO. 1)和CrGlOH基因的編碼序列(SEQ ID NO. 2)，分別設計擴增出完整編碼框的上下游特異引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建植物表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank上登錄的長春花CrSTR基因(SEQ IDNO. 1)和CrGlOH基因(SEQ ID NO. 2)的編碼序列完全一致。引物序列為str-F 5' -GCGGATCCATGGCAAACTTTTCTGAATCTAAATCCAT-3’GGATCC 為 BamHI 酶切位點str-R 5' TCGAGCTCCT AGCTAGAAAC ATAAGAATTTCCCTTGT-3，GAGCTC 為 SacI 酶切位點glOh-F 5' -GGAGATCTATGGATTACCTTACCATAATATTAAC-3’AGATCT 為 BglII 酶切位點glOh-R 5' TCGGTGACCTTAAAGGGTGCTTGGTACAG-3‘GGTGACC 為 BstEII 酶切位點實施例2含長春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表達載體的構建2.1.中間載體 pCAMBIA1304+的構建以pBI121和pCAMBIA1304為材料，構建植物表達載體pCAMBIA1304+。具體地， Hindlll/EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表達盒及 pCAMBIA1304 大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落抽提質粒酶切驗證。結果表明，植物表達載體 pCAMBIA1304+ 構建成功。2. 2.植物表達載體 pCAMBIA1304+-CrG10H 的構建在上述構建成功的PCAMBIA1304+基礎上，用從長春花中克隆到的CrGlOH基因替換其上的GUS基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pMD18T_CrG10H和pCAMBIA1304+ ；回收 CrGlOH基因和pCAMBIA1304+大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克隆；提取質粒進一步酶切驗證。結果表明，CrGlOH基因已被成功構建到植物表達載體pCAMBIA1304+ 中，從而獲得含CrGlOH基因的植物表達載體pCAMBIA1304+-CrG10H。2. 3.植物表達載體 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H 的構建以上述的pCAMB I Al 304+-CrG 1OH為基礎，用從長春花中克隆的Cr STR基因替換 pCAMBIA1304+-CrG10H 上的 GFP+GUS 基因。具體地，Bglll/BstEII 雙酶切 pMD18T_CrSTR 和 pCAMBIA1304+-CrG10H ；回收 CrSTR 基因及 pCAMBIA1304+_CrG10H 大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克??；提取質粒進一步酶切驗證。結果表明，CrSTR基因已被成功構建到植物表達載體pCAMBIA1304+-CrG10H中，從而獲得含CrSTR和CrGlOH的植物表達載體 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H。本實施例將萜類吲哚生物堿合成途徑關鍵酶基因CrSTR和CrGlOH可操作性地連于表達調控序列，形成含CrSTR和CrGlOH基因的植物表達載體 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高喜樹中喜樹堿含量。實施例3發(fā)根農桿菌介導CrSTR和CrGlOH基因遺傳轉化喜樹獲得轉基因毛狀根3. 1.含植物表達載體PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H發(fā)根農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含CrSTR和CrGlOH基因的植物雙價表達載體 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H轉入發(fā)根農桿菌C58C1中，挑取單克隆菌落進行PCR驗證。結果表明，含CrSTR和CrGlOH基因的植物表達載體已成功構建到發(fā)根農桿菌菌株C58C1中。3. 2.發(fā)根農桿菌介導CrSTR和CrGlOH基因遺傳轉化喜樹3. 2. 1.外植體的預培養(yǎng)
剪取喜樹無菌下胚軸(l-3cm)，接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基(B5)上，25°C暗培養(yǎng)2d。3. 2. 2.農桿菌與外植體的共培養(yǎng)將上述經(jīng)預培養(yǎng)的喜樹下胚軸外植體，放入含活化好的上述發(fā)根農桿菌工程菌的 1/2MS懸液中浸泡10分鐘(輕輕搖晃使外植體與菌液充分接觸)后，取出浸染后的喜樹下胚軸用無菌吸水紙吸干表面菌液，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基4中，暗培養(yǎng)2d。3. 2. 3.毛狀根的誘導和繼代培養(yǎng)將上述的共培養(yǎng)2d的喜樹外植體轉接到除菌固體培養(yǎng)基(B5+Cef500mg/L)中， 250C 16h/ !光照培養(yǎng)2-3周左右，可從外植體傷口處長出毛狀根。剪下(大約l-3cm)的毛狀根，接種于B5+Cef500mg/L培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3周。轉入B5+Cef 250mg/L培養(yǎng)基中繼代篩選，每2周繼代培養(yǎng)一次。經(jīng)過數(shù)次繼代后即可完全脫菌。再將良好的喜樹毛狀根轉入無抗生素的B5培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右。3. 3.轉基因喜樹毛狀根的PCR檢測3. 3. 1.轉基因毛狀根基因組DNA的提取本發(fā)明采用CTAB法提取轉基因毛狀根基因組DNA。剪取3. 2. 3中除菌完畢的轉基因毛狀根5cm左右放入1. 5ml離心管中，加入適量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C預熱，含β巰基乙醇)，用研磨棒將材料充分磨碎。置于65°C水浴鍋中40-50分鐘，其間多次混勻樣品(次/lOmin)，冷卻至室溫后加入等入體積的苯酚，輕輕顛倒混勻乳化lOmin， 12000rpm離心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等體積苯酚/氯仿(1 1)，輕輕混勻，12000rpm離心20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加等體積的氯仿混勻，12000rpm離心 20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加2倍體積預冷的無水乙醇，析出沉淀。用槍頭將沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗滌過夜。次日用75%乙醇再洗滌兩次，吸出上清，室溫晾干，加入30-50 μ 1水溶解沉淀，用RNA酶處理后于_80°C超低溫冰箱凍存，備用。3.3.2.引物設計及PCR檢測在PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H上啟動插入目的基因表達的組成型表達啟動子 CaMV35S及插入基因上分別設計特異性上游及下游引物，用PCR方法對上述毛狀根的總DNA 進行分子檢測，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉基因喜樹毛狀根株系。引物序列為
權利要求
1.一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因插入植物表達載體，構建重組載體；(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉入發(fā)根農桿菌，構建含有重組載體的發(fā)根農桿菌；(3)利用所構建的含有重組載體的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化喜樹，獲得毛狀根；(4)檢測步驟(3)毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因，取篩選結果為陽性的轉基因毛狀根克隆。
2.權利要求1所述一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(1)中的異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因片段以長春花幼苗RNA為模板 PCR獲得。
3.權利要求1所述一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(1)中的植物表達載體為pCAMBIA質?；騪BI質粒。
4.權利要求1所述一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(2)所述的發(fā)根農桿菌為發(fā)根農桿菌菌株C58C1、發(fā)根農桿菌菌株A4或發(fā)根農桿菌菌株 L BA9402。
5.權利要求1所述一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(3)中用含有重組載體的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化喜樹下胚軸，獲得毛狀根。
6.權利要求1所述一種雙關鍵酶基因共轉化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(4)所述的檢測方法為PCR及Southern blotting檢測。
7.一種用于提高喜樹堿含量的重組載體，其特征在于，含有異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術領域的提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，從長春花中克隆出異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶CrG10H的編碼框序列，構建含上述基因的植物雙價高效表達載體，以發(fā)根農桿菌介導法遺傳轉化喜樹獲得轉基因的喜樹毛狀根。本發(fā)明獲得的轉基因喜樹毛狀根中喜樹堿含量顯著提高，喜樹堿含量為對照的4.8倍，羥基喜樹堿含量為對照的2.2倍。單獨轉CrSTR基因的毛狀根喜樹堿含量比對照提高了2.4倍，單獨轉CrG10H基因的毛狀根喜樹堿含量并無明顯提高。本發(fā)明提供了一種提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新方法。
文檔編號A01H5/06GK102212549SQ20111008405
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權日2011年4月2日
發(fā)明者周聰聰, 季倩, 開國銀, 李姍姍, 王偉 申請人:上海師范大學