專利名稱：扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬現(xiàn)代生物技術領域，涉及一種扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法。
背景技術：
利用生物技術改良作物已成為現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展的一個重要途徑。組織培養(yǎng)是生物技 術的基礎。組織培養(yǎng)的成功與否取決于是否具有良好的再生培養(yǎng)方法。馬曉紅等在2008 年27 (3)期《大豆科學》中撰文“大豆整個子葉節(jié)外植體再生體系的建立及與子葉節(jié)、胚尖 再生體系的比較”。該文建立了大豆整個子葉節(jié)外植體再生體系，并對不同大豆外植體再生 體系在再生頻率、出芽數(shù)目、芽伸長情況、再生周期等方面進行比較，研究表明，大豆整個子 葉節(jié)外植體再生體系在再生頻率及出芽數(shù)量優(yōu)于子葉節(jié)再生體系和胚尖再生體系，但再生 周期較長、芽伸長較慢?，F(xiàn)有的扁豆組織培養(yǎng)技術中存在再生能力低、不定芽數(shù)少、再生周期長和基因型 間差異大等難點，利用生物技術改良扁豆，建立一個高效的扁豆再生體系，是現(xiàn)代生物技術 研究人員努力的目標，但在扁豆再生培養(yǎng)方面的研究報道較少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，使組織培養(yǎng)的 扁豆再生能力高、不定芽數(shù)多、再生周期短、各品種間組織培養(yǎng)差異小。為達到上述目的，采用的技術方案是扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，其特征在于 依次包括下列步驟
(1)萌發(fā)培養(yǎng)扁豆種子消毒、浸泡后，種臍向下接種到MS&+ 6-BA 0 0.5 mg/L萌 發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 6天，萌發(fā)無菌苗；
(2)誘導出芽無菌苗去掉原葉、上胚軸和胚根，保留兩片子葉和3cm下胚軸，并在兩 片子葉結合處制造微小傷口，然后轉移到MSB5 + 6-BA 0. 6 2. 0 mg/L + IBAO. 2mg/L不 定芽誘導培養(yǎng)基中誘導13 15天出芽；
(3)培養(yǎng)伸長將步驟(2)得到的外植體轉入不定芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 25天，每 10天換一次新鮮培養(yǎng)基，直至不定芽伸長到3 km ；
(4)生根移栽伸長后轉入MSB5+IBA 0. 1 - 0. 2 mg/L生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，生根2 3 條后，移栽得到再生植株。步驟(1)所述扁豆種子消毒、浸泡是扁豆種子用70%酒精消毒1分鐘，然后用飽和 次氯酸鈉溶液消毒50分鐘，接著無菌水沖洗4次，于無菌水中浸泡1小時。步驟(3)所述伸長培養(yǎng)基為MS& + 6-BA 0.05 mg/L + IBA 0. lmg/L、MSB5 + 6-BA 0. 1 mg/L + IBA 0. 1 mg/L 和 MSB5 + 6-BA 0. 1 mg/L + IBA 0. 2 mg/L 中的一種。本發(fā)明的積極效果是與選用子葉、子葉節(jié)等外植體培養(yǎng)再生植株相比，本發(fā)明采 用扁豆葉腋分生組織再生法，使扁豆產(chǎn)生的不定芽數(shù)目多，封頂芽少，芽伸長較快，再生周 期短，再生植株生長旺盛，各種間組織培養(yǎng)差異較小，重復性好。本扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法適用于各扁豆品種的組織培養(yǎng)。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例中所述萌發(fā)培養(yǎng)基、不定芽誘導培養(yǎng)基、不定芽伸長培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基 中的MS& 無機鹽+ 維生素。MS&培養(yǎng)基中蔗糖濃度為洲，瓊脂濃度為10g/L。用 lmol/L NaOH調節(jié)培養(yǎng)基溶液pH值至5. 8 6. 0。培養(yǎng)溫度為25°C 士 1°C。實施例1
試驗品種為‘青扁豆1號’，30粒。選取飽滿扁豆種子，用自來水沖洗干凈，再用70%酒精消毒一分鐘，用飽和次氯酸 鈉溶液消毒50分鐘，接著無菌水沖洗4次，于無菌水中浸泡1小時。然后種臍向下接種到 MS&萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天。將萌發(fā)的扁豆，去掉種皮、原葉、上胚軸和胚根，保留兩片子葉， 下胚軸留3cm，并在兩片子葉結合處制造微小傷口，將外植體轉移到MSB5 +6-BA 1.0 mg/ L+IBAO. 2mg/L不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天誘導出芽。誘導出芽后，切下整個子葉和部 分下胚軸，將外植體轉入MS& + 6-BA 0. 05 mg/L + IBA 0. lmg/L不定芽伸長培養(yǎng)基中培 養(yǎng)20天。不定芽伸長至3 cm時，切下芽轉入MSB5+ IBA 0. 1 mg/L生根培養(yǎng)基培養(yǎng)10天， 不定芽生出3條根/株，將瓶蓋打開煉苗2天，小心用鑷子取出小苗，溫水洗凈根部殘留瓊 脂，然后種植在盛有滅菌土的營養(yǎng)缽中，溫度控制在20°C左右，2周后移栽大棚或溫室中。青扁豆1號獲得再生植株459株，產(chǎn)生不定芽14 16個/外植體，平均再生頻率 達15. 3個/外植體。組織培養(yǎng)48天，再生周期短，芽伸長快，封頂芽少，扁豆產(chǎn)生的不定芽 數(shù)目多。實施例2
試驗品種為‘青扁豆2號’，30粒。選取飽滿扁豆種子，用自來水沖洗干凈，再用70%酒精消毒一分鐘，用飽和次氯酸 鈉溶液消毒50分鐘，接著無菌水沖洗4次，于無菌水中浸泡1小時。然后種臍向下接種到 MSB5 + 6-BA 0.5 mg/L萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天。將萌發(fā)的扁豆，去掉種皮、原葉、上胚軸和 胚根，保留兩片子葉，下胚軸留3cm，并在兩片子葉結合處制造微小傷口，將外植體轉移到 MSB5 + 6-BA 0. 6 mg/L + IBAO. 2mg/L不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天誘導出芽。誘導出芽 后，切下整個子葉和部分下胚軸，將外植體轉入MS& + 6-BA 0. 1 mg/L + IBA 0. lmg/L不 定芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天。不定芽伸長至3 cm時，切下芽轉入MSB5+ IBA 0.1 mg/L生 根培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，不定芽生出2條根/株，將瓶蓋打開煉苗2天，小心用鑷子取出小苗， 溫水洗凈根部殘留瓊脂，然后種植在盛有滅菌土的營養(yǎng)缽中，溫度控制在20°C左右，2周后 移栽大棚或溫室中。青扁豆2號獲得再生植株267株，產(chǎn)生不定芽8 10個/外植體，平均再生頻率 達8. 9個/外植體。組織培養(yǎng)55天，再生周期較短，芽伸長較快，封頂芽少，扁豆產(chǎn)生的不 定芽數(shù)目較多。實施例3
試驗品種為‘艷紅扁’，30粒。選取飽滿扁豆種子，用自來水沖洗干凈，再用70%酒精消毒一分鐘，用飽和次氯酸鈉溶液消毒50分鐘，接著無菌水沖洗4次，于無菌水中浸泡1小時。然后種臍向下接種到 MSB5 + 6-BA 0.5 mg/L萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天。將萌發(fā)的扁豆，去掉種皮、原葉、上胚軸和 胚根，保留兩片子葉，下胚軸留3cm，并在兩片子葉結合處制造微小傷口，將外植體轉移到 MSB5 + 6-BA 2. 0 mg/L + IBAO. 2mg/L不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)13天誘導出芽。誘導出芽 后，切下整個子葉和部分下胚軸，將外植體轉入MS& + 6-BA 0. 1 mg/L + IBA 0. 2mg/L不 定芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天。不定芽伸長至km時，切下芽轉入MSB5+ IBA 0.2 mg/L生 根培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，不定芽生出3條根/株，將瓶蓋打開煉苗2天，小心用鑷子取出小苗， 溫水洗凈根部殘留瓊脂，然后種植在盛有滅菌土的營養(yǎng)缽中，溫度控制在20°C左右，2周后 移栽大棚或溫室中。艷紅扁獲得再生植株372株，產(chǎn)生不定芽12 14個/外植體，平均再生頻率達 12. 4個/外植體。組織培養(yǎng)M天，再生周期較短，芽伸長較快，封頂芽少，扁豆產(chǎn)生的不定 芽數(shù)目較多。本發(fā)明與選用子葉、子葉節(jié)等外植體再生培養(yǎng)相比，不定芽生長較快且封頂芽少； 產(chǎn)生的不定芽8 16個/株、再生頻率達到8. 9 15. 3個/外植體；再生周期48 55 天，比其它類型外植體的培養(yǎng)時間縮短12 17天；各品種間組織培養(yǎng)再生差異小，重復性 好；再生植株生長旺盛。本扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法適用于各扁豆品種的組織培養(yǎng)。
權利要求
1.扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，其特征在于依次包括下列步驟(1)萌發(fā)培養(yǎng)扁豆種子消毒、浸泡后，種臍向下接種到MSl+6-ΒΑ ο 0.5 mg/L萌 發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 6天，萌發(fā)無菌苗；(2)誘導出芽無菌苗去掉原葉、上胚軸和胚根，保留兩片子葉和3cm下胚軸，并在兩 片子葉結合處制造微小傷口，然后轉移到MSB5 + 6-BA 0. 6 2. 0 mg/L + IBAO. 2mg/L不 定芽誘導培養(yǎng)基中誘導13 15天出芽；(3)培養(yǎng)伸長將步驟(2)得到的外植體轉入不定芽伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 25天，至 不定芽伸長到3 km ；(4)生根移栽伸長后轉入MSB5+IBA 0. 1 0. 2 mg/L生根培養(yǎng)基10天，生根2 3 條后，移栽得到再生植株。
2.根據(jù)權利要求1所述扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)所述扁豆種子消毒、浸泡是指扁豆種子用70%酒精消毒1分鐘，然后用飽和次 氯酸鈉溶液消毒50分鐘，接著無菌水沖洗4次，于無菌水中浸泡1小時。
3.根據(jù)權利要求1所述扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)所述伸長培養(yǎng)基為 MS& + 6-BA 0.05 mg/L + IBA 0. lmg/L、MSB5 + 6-BA 0.1 mg/L + IBA 0. 1 mg/L 和 MS& + 6-BA 0. 1 mg/L + IBA 0. 2 mg/L 中的一種。
全文摘要
扁豆整個子葉節(jié)再生培養(yǎng)方法，屬現(xiàn)代生物技術領域，其特征在于依次包括下列步驟(1)扁豆種子消毒、浸泡后，接種到MSB5＋6-BA0～0.5mg/L萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，萌發(fā)無菌苗；(2)無菌苗去掉原葉、上胚軸和胚根，保留兩片子葉和3cm下胚軸，并在兩片子葉結合處制造微小傷口，然后轉移到MSB5＋6-BA0.6～2.0mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽誘導培養(yǎng)基中誘導出芽；(3)將步驟(2)得到的外植體轉入不定芽伸長培養(yǎng)基中伸長；(4)然后轉入MSB5+IBA0.1～0.2mg/L生根培養(yǎng)基生根，再移栽得到再生植株。本發(fā)明的積極效果是產(chǎn)生的不定芽數(shù)目多，封頂芽少，芽伸長快，再生周期短，再生植株生長旺盛，各種間組織培養(yǎng)差異較小，重復性好。本發(fā)明適用于各扁豆品種的組織培養(yǎng)。
文檔編號A01H4/00GK102057872SQ201010538380
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權日2010年11月10日
發(fā)明者吳寒冰, 周超英, 汪潔, 袁娟, 金彩華 申請人:上海市浦東新區(qū)農業(yè)技術推廣中心