專利名稱：：一種黃瓜高頻率植株再生方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于植物生物
技術領域：
，尤其涉及一種黃瓜高頻率植株再生方法。
背景技術：
：黃瓜組織培養(yǎng)技術的研究起始于上個世紀七十年代(CuttsRHA.PlantSciLett,1975,4:189-193)，但真正取得有用結果的還是在近幾年(陳繼峰，上海農(nóng)業(yè)學報，2007,23:114-118)。用于黃瓜組織培養(yǎng)的外植體的種類很多，如子葉、真葉、下胚軸、葉柄、莖尖、根、合子胚等，大多研究都能得到組織培養(yǎng)小苗。盡管黃瓜組織培養(yǎng)的成功經(jīng)驗很多，但在某些方面還存在著不少問題。首先，黃瓜組織培養(yǎng)具有很強的基因型特異性，植株再生頻率低且不穩(wěn)定，技術的重復性差(候愛菊，朱延明，楊愛馥，等.園藝學報，2003,30:101-103);其次，由于黃瓜再生植株一般要經(jīng)過愈傷組織的形成、不定芽分化、莖芽伸長和生根幾個過程，因而己有的黃瓜植株再生體系，操作技術繁瑣，植株再生周期長(KuijpersAM,BoumanH,KlerkGJ.PlantCellTissOrgCult,1996,1:81-83);第三，多數(shù)研究者傾向通過體細胞胚途徑獲得黃瓜再生植株，但體細胞胚轉化成正常植株的頻率低，且無性系變異大，不利于培育遺傳穩(wěn)定、一致的再生植株(LouH，KakoS.HortiScience,29:906-909)。這些不利因素在一定程度上限制了黃瓜生物工程育種的進展。隨著生物工程技術的迅速發(fā)展，植株快速克隆技術和遺傳轉化技術將在黃瓜生物技術育種中得到廣泛應用，這就需要建立一種操作簡便、周期短、技術穩(wěn)定的高效植株再生體系，但目前的黃瓜離體再生技術體系，并不能完全滿足當前黃瓜生物技術研究的需要。因此，建立一種頻率高、周期短、技術穩(wěn)定，且適用于多個基因型的離體植株再生體系，是當前黃瓜組織培養(yǎng)研究的關鍵。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜高頻率植株再生的方法，以滿足黃瓜生物工程育種研究的需要。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種黃瓜高頻率植株再生方法，由下述步驟組成a、選取黃瓜飽滿、無病蟲的種子，用0.1%氯化滎表面消毒，并接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗，選取粗壯的幼苗切除一片子葉和生長點，制備Flamingo-bill外植體；b、將Flamingo-bill外植體接種到芽誘導培養(yǎng)基上，使其誘導出不定芽；c、將外植體連同不定芽轉入增值培養(yǎng)基，使不定芽的數(shù)量擴大3倍，同時不定芽得以伸長；d、當芽長到12cm時從基部切離外植體，接種到生根培養(yǎng)基，使其生根長成完整植株；e、將具有完整根系的植株移栽到營養(yǎng)土中，使其在自然條件下生長。在步驟a中，0.1%氯化汞浸泡種子的時間為810min，消毒后用無菌水沖洗45次，并用無菌濾紙吸干種子表面水分。在步驟a中，用于Flamingo-bill外植體制備的幼苗苗齡為23d，苗高34cm，下胚軸直徑35mm。在步驟a中，采用無菌手術刀片由上至下將一片子葉和生長點切除，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長度為0.4~0.5cm。在步驟b中，外植體接種方式是將其根部斜插入培養(yǎng)基中，芽誘導培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基附加0.51.0mg/L6-BA(6-節(jié)基腺嘌呤)、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSuc(蔗糖)。在步驟c中，芽增值培養(yǎng)基為附加1.0-1.5mg/L6-BA、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSue的MS培養(yǎng)基。在步驟d中，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基附加20g/LSuc。MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。所述培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光照強度為50pmoHn《s—、光周期為1214h/d。本發(fā)明所用的Flamingo-bill外植體為一種多組織成分的特殊外植體，它由子葉、下胚軸和根三部分組成，實際上就是去掉了一片子葉和生長點的植株，其切口部位，即組織培養(yǎng)植株再生部位，為頂端分生組織所在區(qū)域，其細胞生長速度快、分化能力強，本發(fā)明所得到的再生植株就是由這些細胞發(fā)育而來的。Flamingo-bill外植體具有完整植株的特性，其接種方式相當于"移栽"，這樣根就可以發(fā)揮物質吸收功能，通過下胚軸把激素和營養(yǎng)物質輸送至頂端分生組織細胞，促使這些細胞快速生長、分化成苗。Flamingo-bill外植體這種吸收外源物質的方式優(yōu)越于一般外植體的被動吸收。本發(fā)明有以下優(yōu)點1.整個組織培養(yǎng)過程只使用了一種植物激素，即6-BA，且濃度較低，即在01.5mg/L之間，不容易誘導體細胞無性系產(chǎn)生，且節(jié)約了技術成本2.植株再生過程只包括Flamingo-bill外植體的制備、不定芽的誘導和增值、生根、移栽4個技術環(huán)節(jié)，且操作簡單，提高了生產(chǎn)效率。3.—個Flamingo-bill外植體初代培養(yǎng)可產(chǎn)生35個再生植株，如果再繼代培養(yǎng)一次，又可再生510個植株，植株再生頻率略高于一般外植體。4.Flamingo-bill外植體在芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)1015d可誘導出不定芽，3540d后可伸長到合適高度，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)57d可再生不定根，形成完整植株。從接種到完整植株形成只需要大約45d，大大縮短了植株再生的時間。圖1為第一片真葉剛露出的黃瓜幼苗的形狀示意圖2為Flamingo-bill外植體的形狀示意圖3為Flamingo-bill外植體斜切面長出不定芽的形狀示意圖4為不定芽增值并伸長的形狀示意圖。具體實施例方式實施例l:本發(fā)明的高頻率黃瓜再生植株的方法，其步驟如下a.以自交系'IL69，為試驗材料。自交系'IL69，是從津雜2號自交后代分離得到，具有生長勢強、高抗霜霉病、果型長、有棱等特征。選取無病蟲、飽滿的黃瓜自交系'IL69，種子，用0.1%氯化汞表面消毒8min，消毒后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干種子表面水分后，接種到MS培養(yǎng)基，置于26。C恒溫箱培養(yǎng)成苗。MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。選取粗壯、剛露出真葉的幼苗，幼苗苗齡為2d，苗高3cm，下胚軸直徑3mm，如圖1所示，用無菌的手術刀片從上至下切除一片子葉和生長點，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長度為0.5cm，使余下的部分保持完好，即Flamingo-bill外植體，如圖2所示。b.制備好的Flamingo-bill外植體迅速以根部斜插入的方式接種到芽誘導培養(yǎng)基，芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，在26°C、光強50pmobm—V、光周期14h/d條件下培養(yǎng)。lld在外植體斜切面后發(fā)現(xiàn)第一例不定芽，如圖3所示。12d后換一次新鮮培養(yǎng)基，18d后不定芽數(shù)量達到4個。c.將外植體連同不定芽從芽誘導培養(yǎng)基中移出，保護好其根部以免根折斷，再斜插入到芽增值培養(yǎng)基中，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3+30g/LSuc，在25。C、光強50pmol'm^s-1，光周期14h/d條件下培養(yǎng)。并使根部完全在培養(yǎng)基中，調整外植體的位置以盡量使再生的芽向上生長。10d后單個外植體產(chǎn)生芽的數(shù)量達到約10個，長度約1.5cm，如圖4所示。在本步驟中，芽培養(yǎng)到第10d時，統(tǒng)計芽長度和增值率，其中，增值率=芽總數(shù)/外植體總數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表l。d.當芽苗伸長至2cm時，用刀將其從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2MS+20g/LSuc。溫度和光照條件和步驟c一致。5d后芽基部開始部分愈傷組織化，7d后大部分植株有白色不定根生成，13d后，絕大部分植株己長成完整植株。在本步驟中，統(tǒng)計15d后植株的生根率、平均根數(shù)和平均根長，其中，生根率=生根株數(shù)/接種的株數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表l。e.將已生根的植株從培養(yǎng)基中移出，在自來水下洗去粘附在根上的瓊脂后，移栽到營養(yǎng)土中，營養(yǎng)土的配方為體積比為1:1的珍珠巖和泥炭土的混合基質，使其在自然陰涼處生長，并將底部鑿有4個小孔的透明塑料杯倒扣在苗上，以保證一定的濕度，2d后去掉塑料杯。根據(jù)基質墑情，每天澆水12次。在本步驟中統(tǒng)計再生植株的成活率，成活率=成活的株數(shù)/移栽的總株數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表1。實施例2:在本實施例中，黃瓜材料為自交系'IL69'，取材幼苗苗齡為3d，苗高4cm，下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24i:、光強50pmoHn—、—1，光周期12h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.6mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例l相同。實施例3:在本實施例中，黃瓜材料為自交系'IL69'，取材幼苗苗齡為2d，苗高3.5cm，下胚軸直徑4mm。培養(yǎng)溫度為25。C、光強50^imoHn^s-1，光周期13h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。表1實施例1~3的植株再生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4:以黃瓜自交系'IL103'為材料，自交系'IL103'是從津春4號自交后代分離得到，具有生長勢較強、高抗霜霉病、果型中等、無棱、刺密等特征。取苗齡為2d、苗高3cm、下胚軸直徑4mm幼苗為材料。培養(yǎng)溫度為25X:、光強50^imol'm-2.s"，光周期12h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。試驗結果見表2。實施例5:試驗材料為'IL103'。幼苗苗齡為3d，苗高4cm，下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24。C、光強50pmoHr^s"，光周期13h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。試驗結果見表2。實施例6:試驗材料為'IL103'。幼苗苗齡為2.5d，苗高3.5cm，下胚軸直徑4.5mm。培養(yǎng)溫度為26。C、光強50fimolTn—2^，光周期14h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.8mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSue,芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。試驗結果見表2。表2實施例4~6的植株再生情況芽誘導激素芽增值激素芽長度增值生根平均根平均移栽成實施例6-BA6-BA(cm)率率％K:(cm)根數(shù)活率％41.0mg/L1.5mg/L1.27.8951.84.3900.5mg/L1.0mg/L1.48.31002.14.710060.8mg/L1.2mg/L1.57.5951.73.5100實施例7:以黃瓜材料為自交系'IL67'為試驗材料，自交系'IL67'是從園豐園6號自交后代分離得到，具有生長勢強、生育期長、高抗霜霉病、果型短、無棱等特征。取苗齡為2d、苗高3cm、下胚軸直徑4mm的幼苗為材料。培養(yǎng)溫度為25°C、光強50pmol'm—2's—1，光周期12h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。試驗結果見表3。實施例8:試驗材料為'IL67，。幼苗苗齡為3d，苗高4cm,下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24°C、光強50pmoLm—V1,光周期13h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LAgNO3+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例1相同。試驗結果見表3。實施例9:試驗材料為'IL67'。取材幼苗苗齡為2.5d，苗高3.6cm，下胚軸直徑4.3mm。培養(yǎng)溫度為26。C、光強50pmoHn—V1，光周期14h/d。芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.8mg/L6-BA+0.8mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+0.8mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實施例l相同。試驗結果見表3。表3實施例7~9的植株再生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種黃瓜高頻率植株再生方法，其特征在于由下述步驟組成a、選取黃瓜飽滿、無病蟲的種子，用0.1％氯化汞表面消毒，并接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗，選取粗壯的幼苗切除一片子葉和生長點，制備Flamingo-bill外植體；b、將Flamingo-bill外植體接種到芽誘導培養(yǎng)基上，使其誘導出不定芽；c、將外植體連同不定芽轉入增值培養(yǎng)基，使不定芽的數(shù)量擴大3倍，同時不定芽得以伸長；d、當芽長到1～2cm時從基部切離外植體，接種到生根培養(yǎng)基，使其生根長成完整植株；e、將具有完整根系的植株移栽到營養(yǎng)土中，使其在自然條件下生長。2、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a中，0.1%氯化汞浸泡種子的時間為810min，消毒后用無菌水沖洗45次，并用無菌濾紙吸干種子表面水分。3、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a中，用于Flamingo-bill外植體制備的幼苗苗齡為23d，苗高34cm，下胚軸直徑35mm。4、根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于在步驟a中，采用無菌手術刀片由上至下將一片子葉和生長點切除，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長度為0.40.5cm。5、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b中，外植體接種方式是將其根部斜插入培養(yǎng)基中，芽誘導培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基附加0.5~1.0mg/L6-BA(6-節(jié)基腺嘌呤)、0.51.0mg/LAgNO3和30g/LSuc(蔗糖)。6、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟c中，芽增值培養(yǎng)基為附加1.0~1.5mg/L6-BA、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSue的MS培養(yǎng)基。7、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟d中，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基附加20g/LSuc。8、根據(jù)權利要求l、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。9、根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光照強度為50,ohn-V1，光周期為12~14h/d。全文摘要本發(fā)明公開了一種黃瓜高頻率植株再生方法，由Flamingo-bill外植體的制備、不定芽的誘導和增值、生根、移栽等步驟組成。本發(fā)明在整個組織培養(yǎng)過程只使用了一種植物激素，且濃度較低，不容易誘導體細胞無性系產(chǎn)生，且節(jié)約了技術成本；技術環(huán)節(jié)少，且操作簡單，提高了生產(chǎn)效率；從接種到完整植株形成只需要大約45d，大大縮短了植株再生的時間。文檔編號A01H4/00GK101449658SQ20071019307公開日2009年6月10日申請日期2007年12月6日優(yōu)先權日2007年12月6日發(fā)明者周秀艷,李建吾,秦智偉,胡建斌申請人:河南農(nóng)業(yè)大學