專利名稱：：一種誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥及其應用，屬生物
技術領域：
。
背景技術：
：長期以來煙草種植受許多真菌病、病毒病、細菌病、線蟲病危害，由疫霉菌(寄生疫霉煙草變種)引起的黑脛病、鏈格孢菌引起的赤星病、根結(jié)線蟲引起的線蟲病等都很常見。煙草病害的控制主要依賴于抗病品種和化學農(nóng)藥，目前，生產(chǎn)上還沒有的對這些病害免疫或高抗的煙草品種育成，例如紅花大金元等煙草優(yōu)良品種也因為病害的原因大面積減產(chǎn)，但轉(zhuǎn)基因煙草的應用由于安全顧慮，并未商品化，因此化學農(nóng)藥的使用仍然是云南煙葉病害控制的最主要措施。長期的農(nóng)藥加化肥生產(chǎn)模式使得土壤板結(jié)嚴重，土壤中有機質(zhì)含量、保水能力下降明顯，地下水化肥滲入污染嚴重，病害發(fā)生頻繁，煙葉品質(zhì)也有所下降，煙葉生產(chǎn)的最適宜的優(yōu)質(zhì)耕作土地面積逐漸縮小，不利于煙葉生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。這些問題在一定程度上代表了國內(nèi)煙葉生產(chǎn)上存在的問題。提高土壤肥力、減少土壤污染的綜合技術；基本植煙土壤質(zhì)量保持和調(diào)控關鍵技術研究；煙葉無公害生產(chǎn)技術研究與開發(fā)應用；煙葉無公害綜合生產(chǎn)技術集成與推廣；煙草有害生物的綜合、高效、持久、安全治理技術研究與應用等都己經(jīng)列入了國家重點支持研究的領域。隨著科學技術的進步，各國農(nóng)業(yè)科學家普遍認為，肥料要向高效、復合的方向發(fā)展，即應尋求一種新型肥料，不僅將氮、磷、鉀及微量元素配合使用，而且要將化肥和有機肥結(jié)合起來，發(fā)揮整體優(yōu)勢，以建立良性農(nóng)田生態(tài)循環(huán)體系和作物營養(yǎng)綜合體系，充分利用土壤潛力，達到使作物增產(chǎn)增收最佳效果。目前，世界各國都在借助高科技手段，尋求新的肥源，其中有機無機肥料是研究的重點。國內(nèi)外紛紛開展針對目標作物的生長習性的有機無機復混肥，這樣在提供全面、均衡營養(yǎng)的同時，增加土壤有機質(zhì)含量，提供土壤微生物正常生長所需的環(huán)境，提高土壤營養(yǎng)成分的利用率。植物誘導抗病性也稱系統(tǒng)抗病性，是指經(jīng)誘導物處理后，植物體本身產(chǎn)生的^t多種有害病原菌抗性，而非專一抗性的現(xiàn)象，植物體內(nèi)未直接接觸誘導物的部位也被誘導表達PRs蛋白(病程相關蛋白，Pathogenesisrelatedproteins)是其最重要的生理指標。植物誘導抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時間長和利用安全方便等特點，被認為是植物病害防治的一種新途徑、新技術，目前已成為國際上重要的農(nóng)業(yè)研究領域。為使植物誘導抗病性應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，近20多年來國際上研究篩選有效的抗病誘導物，特別是能商業(yè)化生產(chǎn)的化學藥劑，迄今已發(fā)現(xiàn)2，6-二氯異煙酸(INA)、苯并噻唑類制劑(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可誘導作物產(chǎn)生對黃萎病、枯萎病及葉斑病的抗性，其中苯并噻唑類制劑(BTH)己開始商業(yè)化生產(chǎn)；但因該誘導物為化學制劑，對多數(shù)農(nóng)作物有藥害，因此開發(fā)效果一般。而開發(fā)活的微生物作為誘導物雖可避免這個問題，但實際應用效果常常受到環(huán)境條件的影響，而且誘導物的制備工序復雜，成本較高，開發(fā)難度也很大。目前，研究開發(fā)無污染、施用安全的生物制劑是該領域的熱點，我們曾利用青霉素發(fā)酵的工業(yè)廢棄物開發(fā)了一種誘導植物表達病程相關蛋白的有機肥(專利授權號zl20051(K)10824.8)，它同時具備良好肥效，又可誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。將這種可以誘導植物表達病程相關蛋白的工業(yè)廢棄物添加到復混肥中，同時根據(jù)煙草的生理特點和生產(chǎn)實際需要，設計復混肥中的N、P、K比例，以適應煙草這種喜鉀作物的生長需求，開發(fā)可以誘導煙草病程相關蛋白基因表達，從而誘導產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的專用型有機、無機復混肥。使得該肥在提供煙草正常生長營養(yǎng)需求的同時還可以提高煙草的抗病能力，這不但具有良好的開發(fā)應用前景，還對于煙草生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有積極意義。參考文獻1.Huges，D.W.andGalau,A.G.(1988)，PreparationofRNAfromcottonleavesandpollen.PlantMol.Bio.R印.6:253-2572.MelissaK.Hill,LyonKarinJ.,LyonBruceR.(1999)IdentificationofdiseaseresponsegenesexpressedinGossypiumhirsutumuponinfectionwiththewiltpathogenVerticilliumdahliae.PlantMolecularBiology,40:289-2963.SambrookJ,RussellDW(2001)Molecularcloning:alaboratorymanual.3rdedn..ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過對可誘導植物系統(tǒng)表達PRs蛋白的滅活青霉素生產(chǎn)殘渣的研究，充分考慮煙草生長的實際需求，開發(fā)一種誘導煙草植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的煙草專用有機無機復混肥。本發(fā)明的誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥，該有機無機復混肥成分的質(zhì)量百分比為該有機無機復混肥成分的質(zhì)雖W分比為有機質(zhì)含雖2128'《，全N7.79.4%,P4.37%禾llK1215%，jt他47.648.2%，該有機無機復混肥由下列步驟制成；(1)褐煤預處理，將商品褐煤加熱至20030(TC烘干；(2)有機預混料制備預處理褐煤后，按照干燥褐煤蠶糞廢渣510:15:1的質(zhì)量比，立即將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣和蠶糞倒入預烘干的褐煤中攪拌均勻混合成固體粒料;利用預處理褐煤的熱量保持混合物85°C以上至少20分鐘，以滅活青霉素的固-液廢渣中的青霉菌和殘留青霉素；(3)有機無機復混肥的料制備按硝銨磷肥:硫酸鉀磷酸一銨:鈣鎂磷肥硫酸亞鐵有機預混料2428:2430:510:46:00.5:25.743的質(zhì)量比充分混合各物料，用常規(guī)的設備擠壓造粒，即得粒徑3-6mm的到誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的煙草專用有機無機復混肥。本發(fā)明的誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥，以基肥、追肥的形式施用，作為誘導煙草表達病程相關蛋白從而產(chǎn)生抗病性及提供生長營養(yǎng)需求的應用。本發(fā)明具有效果佳、有廣泛應用領域等優(yōu)點，特別適應于喜鉀肥的煙草及其它無公害種植的需要及大量農(nóng)藥才能控制病害的作物。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一、有機活性誘導劑的制備(1)褐煤預處理，將商品褐煤加熱至20030(TC烘干。(2)有機預混料制備預處理褐煤后，按照干燥褐煤蠶糞廢渣510:15:1的質(zhì)量比，立即將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣和蠶糞倒入預烘干的褐煤中攪拌均勻混合成固體粒料;利用預處理褐煤的熱量保持混合物85C以上至少20分鐘，以滅活青霉素的固-液廢渣中的青霉菌和殘留青霉素。(3)有機無機復混肥的料制備按硝銨磷肥:硫酸鉀磷酸一銨:鈣鎂磷肥硫酸亞鐵有機預混料2428:2430:510:46:00.5:25.743的質(zhì)量比充分混合各物料，用常規(guī)的設備擠壓造粒，即得到粒徑為3-6mm誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥。(4)將制備的樣品按常規(guī)標準檢測，成分的質(zhì)量百分比為該有機無機復混肥成分的質(zhì)雖n分比為有機質(zhì)含雖:2128%，全N7.79,1。/。，P4.370/。和K12l5%，其他47.648.2%。二、煙草誘導抗病性試驗1、病原菌的拮抗實驗煙草赤星病病原菌(97008、97009)、煙草青枯病病原菌Tb-23、煙草黑脛病菌98Pn009的菌株在PSA平板上活化8天后，向平板內(nèi)倒入15ml無菌水，收集孢子及菌絲體懸液；用無菌紗布濾去菌絲體，得孢子懸液，備用。吸取病原菌孢子懸液0.5ml，加入到熔化并冷卻到5(TC的6ml的PSA培養(yǎng)基內(nèi)，混合均勻后，作為上層培養(yǎng)基，傾覆在預先已凝固的PSA平板上。待上層培養(yǎng)基凝固后，在每塊平板上放置4個牛津杯(直徑內(nèi)一0.6cm、外—0.8cm，高1.0cm)，用移液槍分別向每個牛津杯內(nèi)加入供試農(nóng)藥500倍或1000倍液或無菌水各200ul，然后將平板放置在26'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72h后，測量抑菌圈的直徑。結(jié)果表明，幾種病原菌均能正常生長，為觀察到明顯抑菌圈的存在，表明該有機無機復混肥沒有直接抑制或殺滅這幾種病原菌的作用。2、病原菌的接種試驗a.樣品水提液的制備取該有機無機復混肥200g，加蒸餾水至10L,浸泡24小時，過濾得到2%濃度的水提液，或稀釋到所需濃度。b.對煙草黑脛病的誘導抗性實驗煙草品種"紅花大金元"(7W'co"朋atatec"歷cv.HongDa)，漂浮育成苗，移栽入裝有園土得花盆中，于25'C的條件下培養(yǎng)，選長勢一致的健康苗200株，用0.5-2%的煙草專用有機無機復混肥水提液灌根，以普通煙草專用肥作為對照，按標準方法接種疫霉菌(寄生疫霉煙草變種98Pn009)的孢子，以植株l/3以上部分出現(xiàn)黑脛病癥狀作為指標，統(tǒng)計病株率，可知該樣品對煙草黑脛病害的防治效果。實驗結(jié)果發(fā)病株率比各自空白對照顯著降低29%-52%，說明本發(fā)明的有機無機復混可以顯著誘導煙草提高對黑脛病的抗性。3、病程相關蛋白基因表達檢測a.樣品水提液的制備取該有機無機復混肥200g，加蒸餾水至10L,浸泡24小時，過濾得到2%濃度的水提液，或稀釋到所需濃度。b.煙苗的培養(yǎng)和誘導取煙草品種"紅花大金元"(yWco"朋atatec鵬cv.HongDa)漂浮育成苗，移栽入裝有園土得花盆中，于25'C的條件下培養(yǎng)，選長勢一致的健康苗，用0.5%的煙草專用有機無機復混肥水提液灌根，以普通煙草專用肥作為對照。于灌根后6、8、12、24、48h、72h取下葉片，置液氮中冷凍固定，然后于-8(TC下保存?zhèn)錅y。c.總RNA的提取根據(jù)Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改進方法，分別提取各處理組的子葉總RNA。利用260/280光吸收值和瓊脂糖電泳的方法確保各樣品濃度和質(zhì)量一致；d.PR蛋白基因表達的檢測每個樣品取10ugRNA經(jīng)過甲醛變性膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至Hybond-N+膜上，亞甲蘭染色，根據(jù)28SrRNA的量，確保膜上每個樣品RNA的濃度和質(zhì)量得一致性。將8種不同PRs蛋白基因片段(見表l)以內(nèi)切酶切下后，利用隨機引物法將片段標記32pdCTP，作為探針，用于Northern雜交分析。Northern雜交根據(jù)標準方法進行(Sambrooketal.，2001)，雜交完成后壓X-光片(Kodark)-80°C曝光5-6天。根據(jù)X-光片上的曝光強度可以直觀的觀察到不同處理時間各種PR蛋白基因的相對表達量。表l、用于標記探針的質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>e.試驗結(jié)果對煙草根部不同時間的水提液處理，利用Northern雜交的方法，在遠離根部的葉片中檢測出PR-lb、PR-3、PR-5、酸性幾丁質(zhì)酶等4種PR蛋白基因出現(xiàn)持續(xù)性的誘導表達。己知PRs蛋白的易位累積，均不是通過轉(zhuǎn)移從感染部位或誘導物處理部位移動到其它部分的，因此在未直接處理物的葉片檢出部分PR蛋白的大量表達，說明本發(fā)明制作的有機無機復混肥能夠誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性(systemicacquiredresistance)，而不僅僅是局部抗性(localresistance)。4、煙草大田施用試驗a.試驗處理實驗材料為煙草品種K326，時間2006年4月28日移栽，地點云南大理處理一本發(fā)明涉及的煙草專用有機無機肥每畝施用量為65kg，每株施58.5g。處理二本發(fā)明涉及的煙草專用有機無機肥每畝施用量為50kg,每株施45.0g。處理三本發(fā)明涉及的煙草專用有機無機肥每畝施用量為35kg，每株施31.5g。處理四煙草專用復合肥(NPK比為1:1:2.5)。試驗設四個處理三次重復，小區(qū)隨機排列，共12個小區(qū)，每個小區(qū)栽煙25株，行株距為L2X0.5m。施用煙草專用復合肥的對照，每千株煙施氮量為7.5kg，移栽時每株煙塘施810克煙草專用復合肥，移栽后十五天，將余下肥料全部施完。施用活性有機無機復混肥的處理，肥料于移栽時一次性施入。試驗的田間管理按優(yōu)質(zhì)煙栽培技術措施進行。b試驗效果對大田煙株生長的影響方差分析結(jié)果，有機無機肥的不同施用量處理與煙草專用復合肥的處理在葉面積系數(shù)、平均留葉數(shù)、平均株高、平均徑圍差異不顯著(見表一)，從首次采烤時間、末次釆烤時間上，以上各施肥處理無明顯差異。表一、不同處理田間生物學調(diào)査結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>田間花葉類病毒病調(diào)查結(jié)果封頂前對各處理的田間花葉類病毒病(CMV、TMV)進行調(diào)查，結(jié)果見表二，用病情指數(shù)進行方差分析，各處理在5%水平上差異不明顯。但從調(diào)査結(jié)果看，施用煙草專用有機無機肥的處理，田間花葉類病毒病的發(fā)病株率和病情指數(shù)都比施用煙草專用復合肥的對照低，說明施用煙草專用有機無機肥后對提高煙株的田間抗病性有一定的作用。_表二、不同處理花葉病發(fā)生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四6.6A13.9對烤煙產(chǎn)值量的影響施用有機無機肥的不同處理其畝產(chǎn)量、畝產(chǎn)值、上中等煙比例均高于施用煙草專用復合肥的對照。而均價則以有機無機肥每畝施用量為50kg的處理最高，施用煙草專用復合肥的對照最低(詳見表三)。從畝產(chǎn)量看有機無機肥每畝施用量為65kg的處理，其產(chǎn)量最高，每畝產(chǎn)量175kg，其次為有機無機肥每畝施用量為50kg的處理，每畝產(chǎn)量173.6kg，有機無機肥每畝施用量為35kg的處理，每畝產(chǎn)量164.4kg，施用煙草專用復合肥(千株施氮量7.5kg)的處理，每畝產(chǎn)量155.7kg。從畝產(chǎn)值看:有機無機肥每畝施用量為50kg的處理，其產(chǎn)值最高，每畝產(chǎn)值1992.67元，其次為有機無機肥每畝施用量為65kg的處理，每畝產(chǎn)值1889.13元，有機無機肥每畝施用量為35kg的處理，每畝產(chǎn)值1834.70元，施用煙草專用復合肥(千株施氮量7.5kg)的處理，每畝產(chǎn)值最低為1594.03元。從上中等煙比例看:有機無機肥每畝施用量為35kg的處理，上中等煙比例達90.9%，有機無機肥每畝施用量為50kg的處理，上中等煙比例達88.4%，施用煙草專用復合肥(千株施氮量7.5kg)的處理，上中等煙比例為87.1%，有機無機肥每畝施用量為65kg的處理，上中等煙比例最低為86.9%。綜合以上結(jié)果可以得出本發(fā)明涉及的煙草專用型有機無機肥每畝施用量為50kg的處理較好，其畝產(chǎn)量、畝產(chǎn)值、上中等煙比例、均價都較高。表三、不同處理對產(chǎn)值量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例一將商品褐煤加熱至300。C烘干，按照干燥褐煤蠶糞廢渣5:5:1的質(zhì)量比，立即將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣和蠶糞倒入預烘干的褐煤中攪拌均勻混合成固體粒料；利用預處理褐煤的熱量保持混合物85。C以上至少20分鐘，以滅活青霉素的固-液廢渣中的青霉菌和殘留青霉素，按硝銨磷肥:硫酸鉀磷酸一銨:鈣鎂磷肥硫酸亞鐵有機預混料25:28:8:4:0.5:34.5的質(zhì)量比充分混合各物料，用常規(guī)的設備擠壓造粒，粒徑4mm，即得到誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥，成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)含量23%，全N8.8y。,P6n/。禾BK14%，其他48.2%。以每畝50公斤的用量(1000株/畝)，將該有機無機復混肥作為基肥施入土中，條施、環(huán)施均可，以每畝50公斤施用常規(guī)煙草專用復合肥作為對照，按常規(guī)移栽漂浮育成煙草苗(品種紅花大金元)，澆灌定根水，常規(guī)栽培、管理，結(jié)果表明黑脛病病株率比對照下降32%，產(chǎn)值提高15%。實施例二基本同實施例。不同之處Xi:用煙草品種K326為供試材料；商品褐煤烘T溫度為20(TC烘",十燥糾煤:査糞廢旌的質(zhì)頃:比為10:1:1;硝酸銨:硫酸鉀磷酸一銨鈣鎂磷肥硫酸亞鐵有機預混料比例為28::30:10:6:0.3:25.7;粒徑3皿n的誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)含量21%，全N9.4%,P7%和K15%，其他仏6%。以每畝50公斤的用量(1000株/畝)，將該有機無機復混肥作為基肥施入土中，條施、環(huán)施均可，以每畝50公斤施用常規(guī)煙草專用復合肥作為對照，按常規(guī)移栽漂浮育成煙草苗(K326)，澆灌定根水，常規(guī)栽培、管理，結(jié)果表明黑脛病病株率比對照下降26%，赤星病病株比率下降12%，產(chǎn)值提高13%。實施例三基本冋實施例-。不同之處為商品褐煤烘干溫度為25(TC烘干，干燥褐煤蠶糞廢渣的質(zhì)雖比為7:2:1;硝酸銨硫酸鉀磷酸.鄰爭5鎂磷肥硫酸亞鐵有機預混料比例為24:24:5:4:0:'13;褐煤加熱溫度為250。C，保持混合物85。C以h22分；粒徑l()腿的誘導煙草抗病的煙草^用有機無機復混肥成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)含量28%，^N7.7%，P4.3%禾l'.lK12%，其他48%;以每畝50公斤的用量(1000株/畝)，將該煙草專用型有機無機復混肥作為基肥施入土中，條施、環(huán)施均可，以每畝50公斤施用常規(guī)煙草專用復合肥作為對照，按常規(guī)移栽漂浮育成煙草苗(品種紅花大金元)，澆灌定根水，團棵期追施煙草專用型有機無機復混肥15公斤，常規(guī)栽培、管理，結(jié)果表明黑脛病病株率比對照下降37%，產(chǎn)值提高11%。本發(fā)明的誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥不但可以滿足煙草正常生長需養(yǎng)分，還可以誘導煙草病程相關蛋白基因大量表達，產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，無論盆栽或大田試驗均取得良好肥效和防效，具備了很好的應用開發(fā)前景。權利要求1、一種誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥，其特征在于該有機無機復混肥成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)含量21～28％，全N7.7～9.4％，P4.3～7％和K12～15％，其他47.6～48.2％。該有機無機復混肥由下列步驟制成；(1)褐煤預處理，將商品褐煤加熱至200～300℃烘干；(2)有機預混料制備預處理褐煤后，按照干燥褐煤∶蠶糞∶廢渣5～10∶1～5∶1的質(zhì)量比，立即將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣和蠶糞倒入預烘干的褐煤中攪拌均勻混合成固體粒料；利用預處理褐煤的熱量保持混合物85℃以上至少20分鐘，以滅活青霉素的固-液廢渣中的青霉菌和殘留青霉素；(3)有機無機復混肥的料制備按硝銨磷肥∶硫酸鉀∶磷酸一銨∶鈣鎂磷肥∶硫酸亞鐵∶有機預混料24～28∶24～30∶5～10∶4～6∶0～0.5∶25.7～43的質(zhì)量比充分混合各物料，用常規(guī)的設備擠壓造粒，即得粒徑3-6mm的到誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的煙草專用有機無機復混肥。2、權利要求1所述的有機無機復混肥，以基肥、追肥的形式施用，作為誘導煙草表達病程相關蛋白從而產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性及提供生長營養(yǎng)需求的應用。全文摘要誘導煙草抗病的煙草專用有機無機復混肥及其應用，屬生物
技術領域：
。復混肥成分質(zhì)量百分比為有機質(zhì)含量21～28％，全N7.7～9.4％，P4.3～7％和K12～15％，其他47.6～48.2％。制備方法為將褐煤加熱至200～300℃烘干；按褐煤∶蠶糞∶廢渣5～10∶1～5∶1的質(zhì)量比，立即將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣和蠶糞倒入預烘干的褐煤中混合成固體粒料；保持混合物85℃以上至少20分鐘；按硝銨磷肥∶硫酸鉀∶磷酸一銨∶鈣鎂磷肥∶硫酸亞鐵∶有機預混料24～28∶24～30∶5～10∶4～6∶0～0.5∶25.7～43的質(zhì)量比混合，得到復混肥。該復混肥作為誘導煙草表達病程相關蛋白從而產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性及提供生長營養(yǎng)需求的應用。具有效果佳、施用方便等優(yōu)點，適宜煙草的無公害生產(chǎn)。文檔編號C05C1/00GK101113118SQ20071006603公開日2008年1月30日申請日期2007年7月16日優(yōu)先權日2007年7月16日發(fā)明者姬廣海,李正躍,李秀軍,楊紅元,林谷潤,陳穗云申請人:云南大學