專利名稱：一種預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用生物工程領(lǐng)域中的技術(shù)手段預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從McPherron等(1993)發(fā)現(xiàn)生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)基因以來，GDF9基因在小鼠、大鼠、綿羊、人等物種中相繼被克隆分析。Incerti等(1994)用小鼠的GDF9的cDNA作為探針，從小鼠的129SvEv基因組文庫中分離了包含GDF9基因的大于20kb的序列，研究發(fā)現(xiàn)GDF9基因由一個2.9kb的內(nèi)含子隔開的兩個外顯子所編碼。McGrath等(1995)報道GDF9在成年小鼠卵巢中特異性表達，使用原位雜交方法，GDF9 mRNA的表達被唯一定位在卵母細胞上。Dong等(1996)在對小鼠發(fā)育中轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的功能分析中，識別了一個新的家族成員——生長分化因子9，它對卵巢卵泡發(fā)生是必需的；GDF9 mRNA僅在卵母細胞中表達；GDF9不足的雌性小鼠，卵泡發(fā)育受阻，導(dǎo)致完全不育；GDF9是體內(nèi)體細胞功能所必需的第一個卵母細胞衍生的生長因子。Jaatinen等(1999)報道大鼠GDF9多肽長度是440個氨基酸，成熟肽是135個氨基酸，GDF9蛋白在大鼠卵巢初級卵泡的卵母細胞中高度表達，表明它主要在卵泡發(fā)生早期起作用。Bodensteiner等(1999)在小鼠和人的GDF9基因外顯子2同源區(qū)域設(shè)計1對引物，并用該引物對綿羊基因組進行擴增，通過噬菌斑雜交對綿羊的GDF9基因文庫進行鏡檢，分離出綿羊GDF9基因全序列(GenBank登錄號AF078545)。Bodensteiner等(2000)首次證實GDF9 mRNA表達被唯一定位到綿羊卵母細胞。Sadighi等(2002)根據(jù)綿羊的最新基因圖譜，將GDF9基因定位在第5號染色體的BM7247到BMS2258之間。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用羊GDF9基因多態(tài)性方便、可靠地預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法。
一種預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析，檢測GDF9基因的第152位堿基是A還是G。
GDF9基因的第152位堿基是A或G，導(dǎo)致了其編碼氨基酸的不同，使該位點的氨基酸殘基為天冬酰胺或天冬氨酸。
所述對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析的方法是用下述引物對羊的基因組DNA進行PCR擴增
F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′然后進行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。
引物是根據(jù)Bodensteiner等(1999)報道的綿羊GDF9基因全序，用Oligo 6.0軟件在外顯子1處設(shè)計的，片段為162bp，當(dāng)?shù)?52位堿基是A時，其純合型羊的基因型為AA；當(dāng)?shù)?52位堿基是G時，其純合型羊的基因型為BB；雜合型羊的基因型為AB；基因型為AA的產(chǎn)羔數(shù)大于AB型。
所述單核苷酸多態(tài)性檢測用單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)方法進行。
本發(fā)明的方法特別適用于綿羊產(chǎn)羔數(shù)的預(yù)測。尤其是在小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？说绕贩N中得到了充分驗證。4個綿羊品種均檢測到AA基因型，AB基因型只出現(xiàn)在湖羊、多賽特羊和薩?？搜蛑校瑑H在薩?？搜蛑袡z測到BB基因型；在4個綿羊品種中，A等位基因頻率明顯高于B等位基因頻率。
本發(fā)明巧妙地利用PCR-SSCP法檢測羊GDF9基因的SNPs，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？搜騁DF9基因的多態(tài)性。并以生長分化因子9基因作為候選基因，發(fā)現(xiàn)了其與羊高繁殖力之間的關(guān)系。用本發(fā)明引物擴增的片段的AA型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)之間存在極顯著的正相關(guān)。為綿羊繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供了依據(jù)。本發(fā)明的方法在羊，尤其是綿羊的育種中具有重要的理論和現(xiàn)實意義，并且在畜牧繁育中將得到廣泛應(yīng)用。


圖1為用本發(fā)明引物對不同綿羊品種擴增片段的SSCP分析圖2為綿羊GDF9基因cDNA 152處AA和BB基因型的序列比較具體實施方式
本發(fā)明中所用的材料及實驗方法1、實驗材料小尾寒羊50只、多賽特羊50只、薩?？搜?0只，血樣均采自北京市興綠原農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司種羊場(北京市順義區(qū)楊鎮(zhèn))；湖羊130只血樣采自浙江省余杭湖羊場。具有產(chǎn)羔記錄的小尾寒羊母羊(150只)血樣采自山東省嘉祥種羊場。所采血樣均為10ml/只，血樣用ACD抗凝，-20℃凍存。
2、羊血液中DNA的提取冷凍血液在室溫融化以后，取700μl移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動，12000g離心15分鐘，棄去上清液
↓再取700μl血液移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動，12000g離心15分鐘，棄去上清液↓加入600μl DNA抽提緩沖液，重懸沉淀物↓加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，混勻，用封口膜封住↓55℃水浴過夜↓將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，直至兩相混合形成乳濁液，12000g離心，10分鐘↓取上清，再加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心，10分鐘↓取上清，加入等體積酚氯仿，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心，10分鐘↓取上清，加入等體積氯仿，緩慢的顛倒離心管10分鐘，12000g離心10分鐘↓取上清，加入2倍體積的無水冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動離心管，可見白色DNA沉淀↓將DNA挑出放到1.5ml離心管中，12000g離心10分鐘，去上清，然后加4℃預(yù)冷的70％乙醇洗兩次，12000g離心10分鐘，去上清↓將DNA干燥(注意不能太干燥)↓加適量TE溶解3、數(shù)據(jù)處理配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較產(chǎn)羔數(shù)在標(biāo)記基因型之間的差異yij＝μ+Gi+eij其中yij為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值(第1胎產(chǎn)羔數(shù)，第2胎產(chǎn)羔數(shù))；μ為群體平均值；Gi為第i種標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；eij為隨機殘差效應(yīng)。用SAS的GLM(General LinearModel)過程完成。
引物設(shè)計根據(jù)Bodensteiner等(1999)報道的綿羊GDF9基因全序，用Oligo 6.0軟件在外顯子1處設(shè)計1對引物，擴增片段為162bp，引物由上海生工生物工程公司合成。
引物F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′本研究建立的最佳PCR條件如下反應(yīng)體系為25μl10×緩沖液2.5μl，Mg2+終濃度為2.0mmol/L，引物50ng，dNTP終濃度為200μmol/L，1U TaqDNA聚合酶，模板100ng。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，63℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4、SSCP分析2μl PCR產(chǎn)物和5μl的上樣緩沖液(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)，98℃變性10min，迅速插入冰中，放置5min，使之保持變性狀態(tài)。樣品在14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)中電泳。電泳結(jié)束后，進行銀染顯帶。
5、克隆測序經(jīng)SSCP分析后，不同純合基因型個體的PCR擴增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳并回收，回收后的DNA用pMD-18T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，酶切鑒定后，在PE377測序儀上測序。
實施例1、采用PCR-SSCP技術(shù)分析GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩福克羊4個綿羊品種的多態(tài)性。
1、PCR擴增用所設(shè)計的引物對不同綿羊品種的基因組進行擴增，所得PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，擴增片段與目的片段大小一致且特異性好，可直接進行SSCP分析。
2、SSCP檢測結(jié)果用引物的擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測，在擴增片段上發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB和BB，結(jié)果如圖1所示，圖中1，3，5，7為AB型；2為BB型；4，6為AA型。
3、不同基因型的純合子個體的克隆測序?qū)兒献觽€體進行克隆測序，如圖2所示，結(jié)果表明，AA型與GenBank(AF078545)中序列一致，而BB型與AA型相比在cDNA的第152處有一個A→G的單堿基突變，導(dǎo)致第51個氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷?br> 4、不同綿羊品種GDF9基因型頻率和基因頻率分析對小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩福克羊進行了GDF9基因型檢測，計算了不同綿羊品種的基因型頻率和基因頻率，統(tǒng)計結(jié)果見表1。
表1 4個綿羊品種GDF9基因的基因頻率和基因型頻率

由表1可見4個綿羊品種均檢測到AA基因型，AB基因型只出現(xiàn)在湖羊、多賽特羊和薩福克羊中，僅在薩?？搜蛑袡z測到BB基因型；在4個綿羊品種中，A等位基因頻率明顯高于B等位基因頻率。
實施例2 GDF9基因擴增片段與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析1、GDF9基因擴增片段對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的影響方差分析表明，GDF9基因擴增片段對小尾寒羊第一胎產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P＜0.05)，對第二胎產(chǎn)羔數(shù)有極顯著影響(P＜0.01)。
2、GDF9基因擴增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤GDF9基因擴增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值(LSM)及標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)見表2。由表2可見，擴增片段兩種基因型第一胎產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值的關(guān)系是AA＞AB，并且兩者之間差異顯著(P＜0.05)，AA型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)比AB型多0.30只。兩種基因型第二胎產(chǎn)羔數(shù)最小二乘平均值的關(guān)系也是AA＞AB，并且兩者之間差異極顯著(P＜0.01)，AA型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)比AB型多0.77只。
表2 GDF9基因擴增片段不同基因型的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

注同一位點同一性狀具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著，小寫為顯著(P＜0.05)，大寫為極顯著(P＜0.01)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析，檢測GDF9基因的第152位堿基是A還是G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析的方法是用下述引物對羊的基因組DNA進行PCR擴增F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′R5′GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT3′然后進行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于當(dāng)?shù)?52位堿基是A時，其純合型羊的基因型為AA；當(dāng)?shù)?52位堿基是G時，其純合型羊的基因型為BB；雜合型羊的基因型為AB；基因型為AA的產(chǎn)羔數(shù)大于AB型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性檢測用單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)方法進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述羊為綿羊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，其特征在于所述羊的品種為小尾寒羊、湖羊、多賽特羊和薩?？?。
7.權(quán)利要求1所述的方法在羊畜牧繁育中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的方法在羊育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法及其應(yīng)用。目的是提供一種利用羊GDF9基因多態(tài)性方便、可靠地預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法。本發(fā)明預(yù)測羊產(chǎn)羔數(shù)的方法，是對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析，檢測GDF9基因的第152位堿基是A還是G。所述對羊GDF9基因多態(tài)性進行分析的方法是用下述引物對羊的基因組DNA進行PCR擴增F5′TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG3′，R5′GCCTTATAGA GCCTCTTCA TGT3′，然后進行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測，以比較GDF9基因在不同品種羊中的多態(tài)性。本發(fā)明的方法在羊，尤其是綿羊的育種中具有重要的理論和現(xiàn)實意義，并且在畜牧繁育中將得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號A61D19/00GK1523119SQ03104508
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月17日
發(fā)明者儲明星, 李碧俠, 王金玉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所