專利名稱：用于處理土壤的微生物以及獲得它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于處理土壤、含有活的微生物的產(chǎn)品，所述微生物可在不同的氣候和自然環(huán)境下繁殖，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的方法，以及使用該產(chǎn)品處理土壤和植物的方法。
具體而言，本發(fā)明涉及一種從下列任何一種微生物，或其混合物制備所述產(chǎn)品的方法。
此外，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)所用微生物的培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明的主題還有微生物本身。
更具體而言，本發(fā)明涉及一種使用一種產(chǎn)品處理土壤和植物的方法，該產(chǎn)品含有微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001291)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001301/-中的至少一種，此外，含有所列微生物的產(chǎn)品可在所討論的植物環(huán)境中繁殖并生存，本發(fā)明還涉及它們的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在自然環(huán)境下，土壤的天然培養(yǎng)基是植物和微生物的自我調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)，前者的存在可決定后者的存在。當(dāng)在進(jìn)化過程中發(fā)展起來的平衡被人類活動(深度耕田，自然和人工施肥，使用植物-保護(hù)劑等)所改變時，其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不可預(yù)知的變化。在不同的土壤上和不同的氣候環(huán)境下，對于優(yōu)化培養(yǎng)給定的植物時所需的微生物群的生長而言，選擇時間要持續(xù)很多年。然而，可在土壤中運(yùn)送有利微生物群的決定性微生物，而且優(yōu)化培養(yǎng)所需的環(huán)境可在1-2天內(nèi)建立。這樣做的結(jié)果是產(chǎn)率更高，不會有害地打亂自然生態(tài)系統(tǒng)。存在于從經(jīng)濟(jì)角度看較為重要的已知植物環(huán)境中的有益且占優(yōu)勢的微生物可通過實驗室實驗測定，并且可利用工業(yè)方法單獨繁殖它們，并以適當(dāng)?shù)谋壤龑⑺鼈兎呕氐酵寥乐小?br> 在土壤和微生物的生態(tài)系統(tǒng)中可發(fā)現(xiàn)重要的規(guī)律性。微生物數(shù)不同，不同的物種可在活植物的根系(rhysosphere)和發(fā)芽種子(spermatosphere)的近環(huán)境中，而不是距離它們更遠(yuǎn)的環(huán)境中確定。細(xì)菌在根環(huán)境中的繁殖受到多種因素的影響。這些因素取決于區(qū)域，土壤的質(zhì)量，微生物群的組成，和氣候環(huán)境。
在土壤中發(fā)現(xiàn)的碳源首先并且絕大多數(shù)是利用太陽能，通過光合作用形成的。
氮循環(huán)比碳循環(huán)更加復(fù)雜。在氮轉(zhuǎn)化時，由生物和化學(xué)過程發(fā)揮作用。在大自然中，以被稱作惰性環(huán)境的氣態(tài)氮為主，固定氮(硝酸鹽，亞硝酸鹽，氨)則以有限的量存在。
對于氮氣的礦化而言，首先涉及生物氮的結(jié)合。因為1公頃有6-7×108噸的分子氮，因此這是用于氮結(jié)合的無盡來源。專家的目標(biāo)在于結(jié)合氮的生物，即可將分子氮還原成氨的活的生物，其中，有關(guān)這些微生物的知識和它們性質(zhì)的適當(dāng)利用可確保以利于環(huán)境的方式，結(jié)束全世界的饑荒。
某些氮結(jié)合細(xì)菌可以自由生活的方式將氮固定，而有些細(xì)菌則只能通過與其它高級植物結(jié)合而將氮固定。
與氮循環(huán)相反，事實上磷循環(huán)在自然環(huán)境中是閉式的。輸入和輸出相等，流失很少，而且磷不會污染空氣。最后，這種元素可在水，海水中積聚，而且只有少量(例如，以鳥糞形式)回到陸地。
在土壤的活細(xì)胞中，磷以有機(jī)化合物的形式積聚，它們的礦化快速(3-8g/m2/年)發(fā)生。現(xiàn)有含磷化合物的溶解性，即它們進(jìn)入植物的可能性有所不同，在平均每1kg的土壤中，只能檢測到400-1200mg磷中的5％。某些磷化合物的循環(huán)周期是500-2000年。
通過將某些分解磷的微生物運(yùn)送到土壤中，可將某些不能進(jìn)入植物中的復(fù)合磷化合物引入到溶液中。如果引入到土壤中的微生物“發(fā)揮作用”，那么土壤的礦物質(zhì)含量則會令人滿意，從而使得含磷酸鹽肥料的使用不再是必需的或可顯著減少使用量。
對于生長而言，植物，特別是在農(nóng)作物成熟時，需要大量的鉀。植物種植者通過在肥料中加入含鉀的物質(zhì)而將鉀引入到土壤中。這種肥料可利用釋放鉀離子的微生物從鉀礦物質(zhì)獲得。
就植物而言，在土壤中繁殖的微生物可生物合成生理上的活性化合物，它們之中，最重要的化合物是植物激素，植物生長素(吲哚-3-醋酸)，乙烯，赤霉素，激動素等。某些假單胞菌可在有微量鐵存在時，產(chǎn)生所謂的鐵載體，它們可收集鐵。因此，其它致植物病的細(xì)菌和真菌因為不能從鐵載體利用鐵，導(dǎo)致由于缺少鐵而受到抑制，另一方面，在缺少鐵的土壤中，這些鐵載體可明顯刺激植物的生長，這是因為通過結(jié)合鐵，它們可直接為植物提供鐵。
對于上述解決方法而言，已經(jīng)詳細(xì)描述過若干技術(shù)版本；在具體的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述了多種微生物。
匈牙利發(fā)明者公開了粉末狀硝化培養(yǎng)物(匈牙利專利HU143.391)，褐球固氮菌和苜蓿中華根瘤菌培養(yǎng)物(匈牙利專利HU188.434)，藻類培養(yǎng)物(匈牙利專利HU195.068)和褐球固氮菌培養(yǎng)物的制品，以及巨大芽孢桿菌微生物(匈牙利專利HU207.751)的制品。褐球固氮菌已經(jīng)保藏，保藏號為No.00238，巨大芽孢桿菌的保藏號為No.NCAIM/P/B1140。更具體而言，在匈牙利專利HU188.434和HU207.751中，作者描述了發(fā)酵培養(yǎng)上述保藏微生物的混合物。按照匈牙利專利HU213 163，作者使用羧甲基纖維素完成了對HU207.751微生物的培養(yǎng)。在HU1671/96中，匈牙利發(fā)明者描述了含有生脂固氮螺菌，維涅蘭德固氮菌，熒光假單胞菌和巨大芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)物。
在上述方法中所用微生物的應(yīng)用和作用會受到下列事實的限制，即在不同的培養(yǎng)環(huán)境下，在不同組成的土壤中，在不同的氣候環(huán)境下，它們只能存活較短的時間，各種植物的環(huán)境和根系不總能創(chuàng)造最佳的條件。
發(fā)明詳述本發(fā)明的基本目的是這種土壤微生物培養(yǎng)物的制品，從植物培養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)的觀點看，它可起有利的作用，且同時，可在不同土壤中和不同植物上，在不同的氣候和培養(yǎng)環(huán)境下存活，繁殖并發(fā)揮它們的有利作用。
人們吃驚地發(fā)現(xiàn)，實驗室培養(yǎng)的微生物的繁殖和存活取決于植物即時環(huán)境中的土壤特性，溫度條件和植物，所述微生物可有利地影響植物的生長，將氮固定，使磷酸鹽轉(zhuǎn)移，刺激植物生長，改善土壤結(jié)構(gòu)。不同的微生物可在ciernozjom土壤，腐殖質(zhì)含量較低的土壤，黃土，田野或例如粘土環(huán)境中發(fā)揮它們的作用。在我們的實驗過程中已經(jīng)證實，然而令人吃驚的是，其它微生物可在各種植物的根系中，或接近它繁殖，并長時間在那里發(fā)揮它們的作用。
因此，進(jìn)行實驗分離這種微生物，它可在從經(jīng)濟(jì)觀點看較為重要的給定植物的環(huán)境中發(fā)揮有利的作用，直到培養(yǎng)它。此外，進(jìn)行實驗分離可使鉀離子轉(zhuǎn)移的微生物，并制備從土壤中分離并通過突變方法在實驗室中改變的這種微生物，它可在引入到土壤中時，在低溫下繁殖，然而甚至令專家吃驚的是，它還可發(fā)揮它們的作用。
此外，我們已經(jīng)在實驗過程中說明，從農(nóng)業(yè)的觀點看，某些產(chǎn)生多糖的微生物可以令人驚奇的方式有利改變土壤結(jié)構(gòu)，由此提高抗旱性。
通過總結(jié)我們的實驗工作，我們的目的是分離這樣的微生物，它可運(yùn)送氮、磷、鉀給植物，生物合成植物生長激素，生物合成可改善土壤結(jié)構(gòu)的多糖，而且能夠在播種期和氣候比較寒冷的國家繁殖，并在不同的土壤和植物中發(fā)揮它們的作用。此外，我們的目的在于生產(chǎn)這種制品，在植物環(huán)境中，在根系中，或直接在植物細(xì)胞之間，它的微生物內(nèi)含物通過使重要的元素固定和轉(zhuǎn)移，并通過在已知植物環(huán)境中產(chǎn)生植物生長因子和多糖，而促進(jìn)已知植物或植物家族的生長，因此我們可節(jié)省肥料的使用，從而保護(hù)環(huán)境。
本發(fā)明的主題是所列微生物的生長過程，含有它們的制品，以及含微生物制品的應(yīng)用以及所述具體微生物。
本發(fā)明是以制造目標(biāo)制品的認(rèn)識為基礎(chǔ)的，微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/和白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B001301/是最適宜的，它們可在播種期的低溫下繁殖，為植物提供氮，使磷、鉀、生物合成生長激素和多糖轉(zhuǎn)移，因此我們分離它們并詳細(xì)描述它們的生長過程。
根據(jù)上述內(nèi)容，1998-1999之間，我們在歐洲從土壤和某些植物的根環(huán)境中分離出了微生物，并在體外測試了它們固定氮、使磷和鉀溶解、產(chǎn)生多糖并生物合成植物激素的能力，從分類學(xué)上鑒定了所選擇的微生物，通過突變處理制備了這種變體，所述變體可在低于20℃的溫度下密集繁殖，詳細(xì)描述了用于培養(yǎng)它們的生長技術(shù)，并從它們的培養(yǎng)物制造出制品，證實了它們對植物生長和溫室產(chǎn)率以及野外實驗的作用。
分離固氮螺菌，固氮菌，慢生根瘤菌，假單胞菌，芽孢桿菌，鏈霉菌和微球菌物種及其亞種。
知之甚少的固氮螺菌物種是革蘭氏陰性可變?nèi)旧募?xì)菌，它們生活在土壤中，在微量需氧(存在1-2％氧)的環(huán)境下，與植物的根系緊密相關(guān)，可將空氣中的氮氣還原成氨，然后將它運(yùn)送給植物。某些種類還可生物合成植物激素。
固氮螺菌是從生長在歐洲不同耕地上、各種土壤和草田中的玉米，小麥，大麥，黑麥的根部環(huán)境分離的。將來源于土壤樣品的細(xì)菌混懸液分散在隨后給出組成的Nfb(II)和MM培養(yǎng)基中，然后在微量需氧的條件下培養(yǎng)。72小時后，鑒定固氮螺菌培養(yǎng)物。固氮螺菌培養(yǎng)物與其它較小的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)物不同，大小達(dá)到約3mm。
當(dāng)在隨后給出組成的液體MM和Nb(II)軟瓊脂培養(yǎng)基中呈指數(shù)生長時，固氮螺菌物種的培養(yǎng)物顯示出固氮螺菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞是vibroid和S-形的，大小為1-2×2-4μm。它們的增加需要生物素。在顯微鏡下觀察，它們可迅速移動。它們的移動性可歸因于它們的極性鞭毛。在它們的細(xì)胞中，聚集聚-β-羥基-丁酸鹽顆粒，和胡蘿卜素。微紅的變色可由培養(yǎng)物老化解釋。為了使它們增加，可使用有機(jī)酸，如蘋果酸，乳酸，丙酮酸和丁二酸?？諝庵械墓潭ㄔ谖⒘啃柩醯沫h(huán)境下進(jìn)行。在極端環(huán)境下，如干燥，低或高pH值，缺少氮源或碳源時，細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胞囊，胞囊上沒有鞭毛，但含有聚-β-羥基-丁酸鹽顆粒，且四周圍繞著莢膜多糖。微生物利用碳源的譜根據(jù)物種而有所不同無乳固氮螺菌葡萄糖+蔗糖+肌醇+巴西固氮螺菌葡萄糖+蔗糖和肌醇-，伊拉克固氮螺菌利用葡萄糖(+)和蔗糖(+)，但不用肌醇(-)，最后，生脂固氮螺菌僅用葡萄糖。在無氮培養(yǎng)基中，碳源利用譜有更大程度的不同，從而可將上述四種物種區(qū)別開來。我們分離的微生物的碳源利用譜部分不同于ATCC 29.731生脂固氮螺菌，無乳固氮螺菌，巴西固氮螺菌和伊拉克固氮螺菌的新型(Holt，J.G.及合作者，Bergeys Manual of Determinative Bacteriology，第9版，1994)。與類型相反，它們在含有3.5％氯化鈉的軟瓊脂中(這將在后面描述)適當(dāng)增加，它們在不同培養(yǎng)時期的顯微照片也有所不同，它們在馬鈴薯提取物瓊脂中產(chǎn)生的顏色更強(qiáng)烈。
某些分離的固氮螺菌與生脂固氮螺菌，無乳固氮螺菌，巴西固氮螺菌以及伊拉克固氮螺菌接近，我們進(jìn)一步對它們進(jìn)行實驗，選擇其中一種巴西固氮螺菌。
上述土壤樣品中的固氮菌微生物是利用選擇培養(yǎng)在Nfb(II)軟瓊脂上分離，然后通過分散在MM和Fjodorov培養(yǎng)基上分離的，并根據(jù)其固定氮的能力選擇一個亞種，貯存進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。它們的細(xì)胞是多態(tài)性、球菌樣的。在有氧存在的條件下，它們迅速移動。它們是革蘭氏陰性菌。它們在沒有氮的培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃綠色的熒光，它們可適當(dāng)利用rhamnoze和mezo-肌醇。
眾所周知，根瘤菌在papilionaceae的根上形成根瘤，然后在植物細(xì)胞中獲得，它們直接把固定氮運(yùn)送給植物。不同的papilionaceae中進(jìn)入不同的根瘤菌，例如大豆中進(jìn)入慢生根瘤菌。因為這種根瘤菌是獨有的，它在收割莊稼后死亡，即，它不會大量存留在土壤中，因此建議使用它處理土壤。7月13日，我們從靠近Szeged-Kiskundorozsma的Subasa的大豆種植園分離出了根瘤菌。從在黃土中生長的植物中，選擇生長較好的植物，從其根部分離生長較好的根瘤。保藏按照實施例分離的微生物的嗜冷變體。
在我們收集的土壤樣品中，我們尋找使磷酸鹽轉(zhuǎn)移的微生物，并從分類學(xué)的角度試驗所選擇的微生物。經(jīng)證實，其中一部分微生物是假單胞菌，另一部分是芽孢桿菌物種。
假單胞菌是革蘭氏陰性、細(xì)棒形式的需氧細(xì)胞，它們在絕大多數(shù)培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素，它們是腐生物。沒有觀察到胡蘿卜素的產(chǎn)生，它們不能在高于40℃的溫度生長。在膠狀瓊脂上見到液化。假單胞菌利用葡萄糖，而不用淀粉。雖然熒光假單胞菌的變體在分類學(xué)上緊密關(guān)聯(lián)，但在我們的微生物和類型組之間可以觀察到某些分類學(xué)異源性我們的微生物假單胞菌的特征在于適當(dāng)?shù)乩闷咸烟牵肴樘?，醋酸，麥芽糖，甘油，和丙酮酸。它不利用果糖，D-阿拉伯糖，麥芽糖，乳糖，淀粉和菊粉。然而與類型相反，它們能夠在木糖，蔗糖上生長，且在一定程度上，可在山梨糖醇上生長。作為獨有的碳源，它們可利用甘氨酸。
以上述為基礎(chǔ)，我們將其中一種微生物鑒定為熒光假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)它近似屬于生物變種III組的變體。我們稱該組為熒光假單胞菌。
以分類學(xué)特征為基礎(chǔ)，在可溶解不溶性磷酸鹽的芽孢桿菌中，經(jīng)證實一些是多粘芽孢桿菌，一些是巨大芽孢桿菌。選擇其中一些組進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。
為了分離能夠使鉀離子轉(zhuǎn)移的微生物，從含鉀的礦物質(zhì)，長石，白云母表面分離微生物，然后按照實施例，在固體、沒有鉀的培養(yǎng)基上進(jìn)行試驗，證實鉀的轉(zhuǎn)移。使用實施例給出的過程，利用突變處理，生產(chǎn)并保藏被鑒定為Streptomyces psychrophilic的微生物。
我們分離出這種微生物，在分類學(xué)，形態(tài)學(xué)及核糖體DNS試驗后，經(jīng)證實為玫瑰色微球菌，它在植物試驗中顯示特別有利的作用。保藏這種微生物的其中一組，這組已經(jīng)在實驗室中被轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還是以下列事實為基礎(chǔ)的，即種植在土壤中的有利作用的微生物可盡可能快地，在種子和植物最初發(fā)育的時候，在秋季和早春的氣候條件下，在氣候較寒冷的國家繁殖。因此，按照實施例4處理、分離并維持該微生物。通過已知的過程，分離在低溫時增加的突變體和變體，然后保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心。
本發(fā)明涉及這種制品及其生產(chǎn)方法，通過施用它們可增加植物培養(yǎng)物的產(chǎn)率。所述生產(chǎn)還伴有培養(yǎng)分離的微生物，并在不同的耕地、不同的植物環(huán)境中測試它們，這些微生物可長時間存在于已知植物家族的環(huán)境中，可在低溫和各種土壤中繁殖，并將含有培養(yǎng)物的制品引入到相關(guān)植物、種子上，或它們的耕地中。根據(jù)本發(fā)明，所述制品可用于處理土壤、植物或植物的種子，它含有下列微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B0012../和白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B0012../中的至少一種。
處理的結(jié)果是促進(jìn)了植物的發(fā)育，而且它們更耐病原體，可為土壤結(jié)構(gòu)和植物提供更多水分，甚至在減少肥料或根本不使用任何肥料的情況下也可提供較高的產(chǎn)率。
本發(fā)明方法其中一個最重要的優(yōu)點是其實施，在植物培養(yǎng)過程中，以氮-，磷-和鉀-為基礎(chǔ)的肥料的施用不再是必需的，或可大量減少。肥料對環(huán)境的污染作用很明顯。在微生物細(xì)胞中生物合成、促進(jìn)植物發(fā)育的化合物可加速已處理植物的發(fā)育，根的發(fā)育，同時增加供給植物的水分，而所施用的微生物可抑制致植物病微生物的發(fā)育，在某些微生物細(xì)胞中生物合成的多糖可改善土壤結(jié)構(gòu)，平衡水分，對土壤壽命特別有利。與已知制品和相同目的及應(yīng)用的制備方法相反，本發(fā)明的制品的制備和應(yīng)用是以從各種土壤中分離出來、具有不同作用的各種微生物的使用為基礎(chǔ)的，這些微生物可對已知在經(jīng)濟(jì)上較為重要的栽培植物發(fā)揮特殊作用，而且它們可在秋天和早春的低溫下，以及氣候寒冷的地區(qū)繁殖。
本發(fā)明的微生物還可在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即所述培養(yǎng)基含有葡萄糖，淀粉，蔗糖，或糖蜜作為碳源，玉米漿，酪蛋白，酵母提取物或銨鹽作為氮源，以及其它無機(jī)鹽和能夠離解微量元素離子的鹽，但是，因為這對于專家而言是顯而易見的，因此可使用任何可同化的碳源和氮源，無機(jī)鹽，只要它們能使本發(fā)明的細(xì)菌繁殖。
可在培養(yǎng)基中將含有本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)物直接加入到所要處理的土壤或植物中用于培養(yǎng)，但是在保持微生物的生物有效性的制品之中，還可制備含有載體的制品，該載體可利用粘附力將細(xì)菌固定在種子中。引入到土壤中的細(xì)菌量為每公頃5×1011-5×1015個細(xì)胞，優(yōu)選的細(xì)胞量為1012-1013。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，我們將從各種植物環(huán)境分離鑒定、并且可在低溫下繁殖的微生物保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心，它們登記的保藏號是巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，
大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B001301/。
保護(hù)范圍還擴(kuò)展至保藏的物種及其人工和天然突變體，變體或以任何已知方式獲得的上述微生物系。
下面，我們用實施例舉例說明，但這些實施例不是對保護(hù)范圍的限制。
除非另有說明，實施例中的百分比是重量百分比。
發(fā)明的最佳實施方式實施例1從各種土壤和各種植物環(huán)境分離可固定空氣中氮的微生物并證實它們固定氮的能力固氮螺菌物種是革蘭氏陰性可變?nèi)旧募?xì)菌，它能夠在微量需氧(有1-2％的氧)的環(huán)境下，將空氣中的氮還原成氨，并將它們用于植物中。
從各種土壤樣品(腐殖土，黃土，鈉質(zhì)土，褐色及黑色的土等)，各種植物(谷類，向日葵，玉米，草等)的根環(huán)境中分離固氮螺菌?；瘜W(xué)吸引劑，如有機(jī)酸和糖可利用趨化性吸引固氮螺菌。在它們鞭毛的幫助下，細(xì)菌向根部移動，到達(dá)那里，并在那里集群。
使用無菌蒸餾水將給定土壤樣品稀釋10-，100-，1,000-和10,000-倍，然后將100-100μl混懸液在含有MM和Nfb(II)軟瓊脂的陪體氏培養(yǎng)皿上擴(kuò)散。MM培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41.65g/lKH2PO40.87g/lMgSO4×7H2O 0.29g/lNaCl0.18g/lCaCl2×2H2O 0.07g/lFeCl3×6H2O 0.01g/lNaMoO4×2H2O 0.005g/lMnSO4×H2O 0.00014g/lZnSO4×7H2O 0.007g/lCuSO4×5H2O 0.000125g/l
CoSO4×7H2O0.00014g/lH3BO30.00003g/l葡萄糖5.0g/l蔗糖 5.0g/lBacto瓊脂 20.0g/l葡萄糖是使用高壓滅菌器，與MM培養(yǎng)基的其它成分分開滅菌的(121℃，30分鐘)，然后在冷卻至60℃后再與其它成分混合。使用無菌的1N NaOH溶液將無菌培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.4。
Nfb(II)培養(yǎng)基的組成如下L-蘋果酸 5.0g磷酸氫二鉀 0.5g硫酸鎂×7水 0.2g氯化鈉 0.1g氯化鈣 0.02g微量元素溶液*2.0ml溴麝香草藍(lán)(溶解在0.2N KOH中的物質(zhì)的0.5％水溶液)2.0mlFe-EDTA的1.564％的溶液 4.0ml維生素溶液**1.0ml瓊脂 1.75g使用1N KOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH6.8。
*微量元素溶液的組成如下硫酸亞鐵II×7H2O200mg氯化鐵III×6H2O 10mg硫酸鎂×H2O 1mg硫酸銅×5H2O2mgNaMoO4×2H2O 1mg氯化鈷×6H2O2mg硫酸鋅×7H2O2mg四硼酸鈉×10H2O 1mgP2O5×24WO3×H2O0.5mg
硝酸鉍×5H2O 0.1mg氯化錫 0.01mg氯化硒 0.01mg碘化鉀 1mg檸檬酸 100mg蒸餾水 1000ml**維生素溶液的組成如下維生素C 50mg維生素B15mg維生素E 2mg維生素A 2mg生物素 4mg蒸餾水 100ml。
將引入到培養(yǎng)基中、在MM平板上找到的細(xì)菌放在厭氧菌恒溫箱中，把恒溫箱氣腔中交換為氮氣，然后利用令人滿意量的空氣回流將氧氣濃度定為1.6％。32℃溫育平板，72小時后，鑒定固氮螺菌。與稀釋線相應(yīng)，在使用10倍稀釋的混懸液擴(kuò)散的平板上，生長出了連續(xù)的細(xì)菌區(qū)域，而10,000倍稀釋的混懸液通常生長出30-50個培養(yǎng)物。固氮螺菌培養(yǎng)物與其它較小的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)物不同，其大小可達(dá)到約3mm。培養(yǎng)物中，有若干種在形態(tài)學(xué)上與固氮螺菌培養(yǎng)物相似。我們將進(jìn)一步研究它們之中的一些。
在上述培養(yǎng)基中和上述培養(yǎng)環(huán)境下，將Nfb(II)軟瓊脂培養(yǎng)物放在需氧菌恒溫箱中，首先，從特征形態(tài)學(xué)方面觀察到固氮螺菌繁殖。
從MM和Nfb(II)培養(yǎng)基獲得的各種固氮螺菌是按照微生物學(xué)實踐生長的，以這種方式，將原代細(xì)菌培養(yǎng)物在完全Tag培養(yǎng)基中的一種培養(yǎng)物上擴(kuò)散兩次。固氮螺菌是通過在液體Tag培養(yǎng)基中的一種培養(yǎng)物上擴(kuò)散兩次而純化的，并貯存在培養(yǎng)物中。將-80℃的細(xì)菌混懸液作為培養(yǎng)物，所有實驗都從該培養(yǎng)物開始。
Tag培養(yǎng)基的組成如下Bacto胰蛋白胨(Difco) 1.0％酵母提取物(Difco) 0.1％
NaCl 0.5％瓊脂 2.5％滅菌后，加入下列終濃度的化合物水溶液0.1％ 0.1M CaCl2×6H2O0.1％ 0.1M MgCl2×6H2O0.2％ 葡萄糖(單獨滅菌)滅菌后，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.0-7.2。
在根的集群可通過簡單的實驗來檢測。根據(jù)顯微鏡計數(shù)可知，與對照組相比，可在播種于貧瘠珍珠巖(15cm直徑的盆)中、細(xì)胞數(shù)相等(每盆1×1010個細(xì)胞)、且用固氮螺菌處理過的玉米和小麥的根上，檢測到明顯更多的固氮螺菌細(xì)胞。根集群可按照特殊的識別機(jī)理進(jìn)行。在定居過程中，固氮螺菌細(xì)胞穿透根基質(zhì)中，在根基質(zhì)中，它們通過固定活性氮可滿足主要植物所需的一部分氮(結(jié)合氮固定)。這是由實驗室實驗過程中，接種了固氮螺菌的玉米和小麥的綠色物質(zhì)生長得更高而證實的，其結(jié)果在后面詳細(xì)描述。固氮螺菌還可產(chǎn)生植物激素和促進(jìn)生長的物質(zhì)。這些物質(zhì)的出現(xiàn)和它們對主要植物的有利作用可由在不同實驗環(huán)境下進(jìn)行的實驗中，發(fā)芽率的增加和植物生長越來越密集來表現(xiàn)。
分離的固氮螺菌物種的形態(tài)學(xué)特征可在下面的一般性描述部分中找到。
在Nfb(II)軟瓊脂上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，然后在沒有氮的MM培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)時，固氮螺菌微生物是從耕地的土壤樣品分離的。根據(jù)分類學(xué)特征和碳源利用譜的不同，以及可在很大程度上用SW5-01-07固定空氣中的分子氮，我們認(rèn)為這些微生物是巴西固氮螺菌，然后，如后面所述，分離在低溫繁殖、并生物合成多糖的變體，將其中之一保藏。
對于固氮菌的分離而言，除了使用上述組成的Nfb(II)和MM培養(yǎng)基之外，還可將土壤樣品在Fjodorov培養(yǎng)基中培養(yǎng)，固氮菌在其中顯示出特征形態(tài)學(xué)性質(zhì)。Fjodorov培養(yǎng)基的組成如下磷酸二氫鉀 0.03％磷酸氫鈣0.02％硫酸鉀 0.02％
硫酸鎂×7水0.03％碳酸鈣 0.5％氯化鈉 0.05％氯化鐵III 0.02％鉬酸鈉 0.0002％甘露糖醇 2.0％Bacto瓊脂 2.0％滅菌前，使用1N氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH7.0。
在Nfb(II)軟瓊脂上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，然后在沒有氮的MM和Fjodorov培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)時，固氮菌微生物是從耕地的土壤樣品分離的。根據(jù)分類學(xué)特征和碳源利用譜的不同，以及可在很大程度上用標(biāo)記M65-01-34固定空氣中的分子氮，我們認(rèn)為這些微生物是維涅蘭德固氮菌，然后，按照下面所述，分離在低溫繁殖的變體，并由我們將其中之一保藏。
固氮螺菌和固氮菌的固氮能力也是通過乙炔還原法測定的。按照該方法(Dilworth M.J.，J.Biochem.Biophys.Acta，27，285，1996)，用注射器將乙炔注射在密閉培養(yǎng)皿的培養(yǎng)物中，溫育12小時后，將0.25ml的氣體混合物注射在Perkin-Elmer氣相色譜的PropakN柱中。氣體混合物中乙炔和乙烯的濃度是用氫火焰電離檢測器測定的。從乙炔和乙烯的峰高，可清楚地推斷固氮酶的酶復(fù)合物活性。固氮螺菌和固氮菌可在1小時內(nèi)，將15-85nmol量的乙炔還原成乙烯。
慢生根瘤菌是2000年7月13日，從靠近Szeged-Kiskundorozsma的Subasa的大豆植物中分離的。從在黃土中生長的植物中，選擇發(fā)育較好的植物，除去其根部發(fā)育較好的根瘤。用無菌蒸餾水清洗根瘤，粉碎，然后將顆?；鞈以谏睇}水溶液中。在無菌條件下，制備混懸液的連續(xù)稀釋液，然后在完全培養(yǎng)基上擴(kuò)散。溫育48小時后，通過所謂的共生植物試驗測定培養(yǎng)物的固氮能力將市售苜蓿(Medicagosativa)種子的表面在72℃熱處理2小時，然后用20％Hypo溶液仔細(xì)清洗而滅菌，然后在含1％瓊脂的蒸餾水培養(yǎng)基中發(fā)芽。將幼苗放在1.5％Gibson斜瓊脂(見后面)上，在溫室中生長1周。用各種細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞接種1周齡的植物，并在溫室中再培養(yǎng)8周。選擇3株生長最好的植物(與對照植物3-5mg的重量相比，根上部分干重22-26mg)，然后從形態(tài)學(xué)和分類學(xué)的角度，我們根據(jù)它們的性質(zhì)稱其為大豆慢生根瘤菌變種PH-2-1-3。
實施例2分離可溶解磷-和鉀-的微生物收集世界各地的土壤樣品，將樣品的水混懸液在Tag培養(yǎng)基(見上文)上擴(kuò)散，然后測試假單胞菌和芽孢桿菌的分離物質(zhì)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
按照微生物學(xué)實踐，各種假單胞菌和芽孢桿菌是通過將原代細(xì)菌培養(yǎng)物在完全TAg培養(yǎng)基的單一培養(yǎng)物上擴(kuò)散若干次而純化的。細(xì)菌增加，并通過在液體和固體TAg培養(yǎng)基中擴(kuò)散而純化貯存。
微生物溶解磷酸鹽的性質(zhì)是在含有1％羥基磷灰石，并補(bǔ)充了修飾的Pikovskaya(HP)和10％磷酸三鈣及葡萄糖(0.2％)的營養(yǎng)瓊脂(Oxoid)培養(yǎng)基中測試的。
實驗過程中所用培養(yǎng)基的組成如下修飾的Pikovskaya培養(yǎng)基羥基磷灰石 1.0％(NH4)2SO40.05％NaCl 0.02％KCl0.02％MgSO4×7H2O 0.01％酵母提取物 0.05％瓊脂 1.5％葡萄糖(單獨滅菌) 1.0％滅菌后，將下列化合物的溶液加入到培養(yǎng)基中1％20mg/100ml FeSO4×7H2O1％40mg/100ml MnSO4×H2O滅菌前，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.2。
Naoxg按照制造商的說明制備的營養(yǎng)瓊脂(Oxoid)+0.2％葡萄糖。
測試在初步實驗中選擇的微生物在Pikovskaya(HP)培養(yǎng)基中溶解磷酸鹽的能力的過程中，在30℃時生長3-4天的培養(yǎng)物產(chǎn)生29-38mm的溶液環(huán)。將使用1ml蒸餾水，從TAg斜瓊脂獲得的相同微生物的細(xì)胞混懸液滴在Naoxg平板的孔上，該平板中還補(bǔ)充了10％磷酸三鈣(0.1ml/孔)。將培養(yǎng)物在30℃溫育，2-3天內(nèi)，觀察到明顯可見的溶液環(huán)。當(dāng)使用假單胞菌時，溶液環(huán)的大小為24mm，當(dāng)使用芽孢桿菌時，溶液環(huán)的大小為26mm，平均大小等于34mm。
每種單獨的假單胞菌和某些芽孢桿菌被證實具有較強(qiáng)的溶解磷酸鹽的性質(zhì)。所述微生物攜帶可在溶液中檢測的無機(jī)磷酸鹽變體，因此它們具有極好的溶解磷酸鹽的性質(zhì)。
以它們的分類學(xué)特征和碳源利用譜為基礎(chǔ)，根據(jù)試驗選出的14種假單胞菌和25種芽孢桿菌是熒光假單胞菌和多粘芽孢桿菌以及巨大芽孢桿菌，它們分別被標(biāo)記為SW1-1-14，SW17-1-15和M32-1-10，分離在低溫下繁殖，并可生物合成大量多糖的變體，并保藏。
可使鉀離子轉(zhuǎn)移的微生物的分離是按照上面所述完成的，區(qū)別在于除去上述組成的Pikovskaya(HP)培養(yǎng)基中的氯化鉀，并加入1％粉碎成細(xì)粉的長石和云母片巖代替羥基磷灰石。
在微生物培養(yǎng)物周圍，產(chǎn)生完全或部分不溶于水溶液中的礦物質(zhì)，形成一個透明帶。
選擇它們中的一些，根據(jù)分類學(xué)特征，形態(tài)學(xué)性質(zhì)和碳源利用譜，我們發(fā)現(xiàn)它們是芽孢桿菌和鏈霉菌，我們將這15組微生物標(biāo)記為No.1-015-0003，然后，如后面所述，分離在低溫下繁殖的變體，并保藏其中之一。
實施例3.分離產(chǎn)生鐵載體和植物激素的微生物按照實施例1和2所述分離的微生物產(chǎn)生鐵載體和激素的能力是利用King B培養(yǎng)基測試的。該培養(yǎng)基的組成如下胨 2％甘油1％K2HPO40.15％MgSO4×7H2O 0.15％瓊脂2％滅菌前，使用氫氧化鈉溶液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.2。
產(chǎn)生鐵載體的假單胞菌可固定鐵離子，然后將鐵離子運(yùn)送給缺鐵土壤中的植物。此外，它們還可抑制某些致植物病微生物，如胡蘿卜軟腐歐文氏菌的繁殖，這是因為它們不能利用固定的鐵。我們通過抑制大腸埃希氏菌MC1061的生長而測試貼載體的產(chǎn)生。用蒸餾水從瓊脂培養(yǎng)物制備兩種微生物的細(xì)胞混懸液，然后滴在不含鐵及含鐵(1μMFeCl3×7H2O)的King B平板(30-50μl)上，28℃培養(yǎng)48小時，接著將從TAg瓊脂獲得的大腸埃希氏菌MC1061培養(yǎng)物噴在平板上，28℃再培養(yǎng)28小時。在培養(yǎng)物周圍可觀察到各種抑制帶。四次實驗的平均結(jié)果在表1中給出，陰性對照組為巨大芽孢桿菌，陽性對照組為熒光假單胞菌。
表1

*抑制程度-無，+低，++和+++高和非常高在使用mob4和陽性對照組測試所產(chǎn)生鐵載體的過程中，可觀察到一個相當(dāng)大的抑制帶，其在有鐵離子存在時停止。
如上所述，某些假單胞菌可產(chǎn)生植物激素。測試所選擇的微生物是否能夠在上述組成的TAg培養(yǎng)基中生物合成ghibberellic酸。試驗是使用ghibberellic酸A標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)，通過(40μg/ml)二氧化硅凝膠(Merck)薄層色譜進(jìn)行的。用醋酸乙酯提取培養(yǎng)物，接著用雙倍體積的碳酸氫鈉提取，然后在pH2.5的溶液中，用醋酸乙酯再次提取。在提取物的蒸發(fā)殘留物中，發(fā)現(xiàn)下列微生物斑點的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品接近
表2

選擇標(biāo)記為SW1-6和M32-1-9的微生物(它們產(chǎn)生約3-15μg激素/毫米)。
測試在一般性部分中描述的微生物，并從分類學(xué)角度鑒定。
實施例4分離產(chǎn)生胞外多糖的微生物4A.慢生根瘤菌的選擇將慢生根瘤菌PH2-1-3在含1％葡萄糖和1％蔗糖的Tag培養(yǎng)基中(見上面)擴(kuò)散，并測試培養(yǎng)物周圍的多糖(粘液)量。選擇可生物合成多糖的PH2-1和-2。
4B.芽孢桿菌的分離將芽孢桿菌M32-1-10和SW17-1-15在含1％葡萄糖和1％蔗糖的Tag培養(yǎng)基中(見上面)擴(kuò)散，并測試培養(yǎng)物周圍的多糖(粘液)量。選擇可生物合成多糖的M32-1-6，8和10以及SW17-1-7，11和15。
經(jīng)證實，在含葡萄糖和蔗糖的完全培養(yǎng)基上分離的微生物是玫瑰色微球菌，它可生物合成大量多糖，而多糖則將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化成粘性物質(zhì)。
按照我們的試驗所選的微生物可生物合成結(jié)構(gòu)已知的水溶性succionoglucone-型多糖。
實施例5耐冷微生物的分離利用致突變劑和輻射處理按照實施例1-4選擇的微生物。用0.01，0.1，1.0，10和100μg/ml亞硝基胍處理使用蒸餾水制備的微生物混懸液1，3，5，10和30分鐘。處理后，將細(xì)胞混懸液離心，用蒸餾水清洗2次，然后將細(xì)胞擴(kuò)散在TAg培養(yǎng)基上。反復(fù)用蒸餾水處理含109個微生物/毫米的細(xì)胞混懸液，在相距10cm的15W UV燈下照射細(xì)胞1，3，5，10和30分鐘，然后利用連續(xù)稀釋將細(xì)胞混懸液在Tag培養(yǎng)基上擴(kuò)散。
將TAg培養(yǎng)物在18℃溫育192分鐘，接著在18℃溫育的TAg斜瓊脂上分離最大的培養(yǎng)物。
控制并維持下列生長培養(yǎng)物。
分離并保藏下列經(jīng)過分離、選擇并耐冷的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/，白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B001301/。
實施例6微生物的培養(yǎng)6A.在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)從TAg培養(yǎng)基制備斜瓊脂培養(yǎng)物，然后在30℃溫育48小時。將固氮螺菌，固氮菌，芽孢桿菌，慢生根瘤菌，假單胞菌，鏈霉菌或微球菌培養(yǎng)物接種在標(biāo)記為Tali、具有下列組成的培養(yǎng)基中葡萄糖(在50％水溶液中單獨滅菌) 0.5％糖蜜1.5％玉米漿(50％干物質(zhì)) 1.5％Gistex酵母提取物0.2％酸性酪蛋白 0.1％硫酸銨 0.1％檸檬酸銨0.1％碳酸鈣 0.3％
硫酸二氫鉀 0.1％氯化鈉 0.1％硫酸鎂×7H2O 0.1％棕櫚油 0.2％將培養(yǎng)基的100-100ml部分填充在500ml的Erlenmeyer-燒瓶中，然后在121℃滅菌30分鐘。使用在斜瓊脂培養(yǎng)物上生長的微生物接種無菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)物的培養(yǎng)是25℃時，在每分鐘旋轉(zhuǎn)260次的旋轉(zhuǎn)工作臺上進(jìn)行36分鐘。然后，使用5％量的接種物，利用顯微鏡試驗觀察生長，接種是在下列組成的Talf主要發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行的葡萄糖(在50％水溶液中單獨滅菌)1.5％糖蜜 2.5％玉米漿(50％干物質(zhì))1.5％Gistex酵母提取物 0.4％酸性酪蛋白0.4％硫酸銨0.2％檸檬酸銨 0.2％碳酸鈣0.3％磷酸二氫鉀0.2％氯化鈉0.1％硫酸鎂×7H2O 0.2％微量元素溶液*0.45％棕櫚油0.2％*微量元素溶液的組成與實施例1相同。
在上述環(huán)境下，將Erlenmeyer-燒瓶和10升總體積、5升凈體積的實驗室發(fā)酵器中的100ml培養(yǎng)基滅菌。
根據(jù)細(xì)菌的不同，當(dāng)每毫升的細(xì)胞數(shù)達(dá)到4×108-1.3×109時，按照常規(guī)方式將放在燒瓶中和發(fā)酵器中的培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)工作臺上培養(yǎng)，培養(yǎng)時進(jìn)行v/v換氣并運(yùn)行帶有2個口的渦輪混合器，每分鐘旋轉(zhuǎn)360次，共旋轉(zhuǎn)24小時。
在制備更大量培養(yǎng)物時，在前述發(fā)酵條件下，在上述組成的Tali培養(yǎng)基上制備10升培養(yǎng)物，然后分別用5-5升接種100升滅菌的Tali和100升Talf培養(yǎng)基。培養(yǎng)在上述環(huán)境下持續(xù)24小時，然后將在土壤中的Talf培養(yǎng)基上生長的培養(yǎng)物，50升在Tali培養(yǎng)基上生長的培養(yǎng)物用于接種1000升滅菌的Talf培養(yǎng)基。培養(yǎng)在上述發(fā)酵環(huán)境下進(jìn)行24小時，然后檢驗，培養(yǎng)物備用。在密集發(fā)泡時，?？杉尤?.01％聚丙二醇消泡劑。
6B.在半極限培養(yǎng)基上培養(yǎng)使用下列組成的Ta2f培養(yǎng)基代替Talf培養(yǎng)基重復(fù)實施例6的方法葡萄糖(在50％水溶液中單獨滅菌)1.5％糖蜜 0.5％酸性酪蛋白0.1％硫酸銨0.7％檸檬酸銨 0.5％碳酸鈣0.3％磷酸二氫鉀0.3％氯化鈉0.1％硫酸鎂×7H2O 0.2％微量元素溶液* 0.35％棕櫚油0.2％*微量元素溶液的組成與實施例1相同。
完成培養(yǎng)后，根據(jù)細(xì)菌的不同，培養(yǎng)物含有1-7×108個細(xì)胞/毫升。
實施例7土壤結(jié)構(gòu)的改善和植物培養(yǎng)實驗7A.用于改善土壤結(jié)構(gòu)的實驗將在靠近Somlyosziget的多瑙河采集的沙土和從Esztergom采集的粘土放在90×90cm的托盤中，層厚25cm。每盤使用10g硝酸銨和5g磷酸鈣處理沙土。以104個種子/盤將玉米播種在盤中。在評估時，我們沒有采納5株最大和5株發(fā)育最不好植物的數(shù)據(jù)。用蒸餾水清洗后干燥2天，然后在45℃時測量根的重量。第1盤大量澆水，第2盤在播種時大量澆水，但之后不澆水。標(biāo)記為“a”的盤是用生物合成多糖的微生物接種的，這些微生物是多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/和大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/，它們保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心，這些微生物的培養(yǎng)物是按照實施例6制備的，每平方米接種每種細(xì)菌的108個細(xì)胞。標(biāo)記為“b”的盤沒有用微生物處理。
表3給出在播種后第33天獲得的結(jié)果。結(jié)果使以一種植物計算的平均值表示的。
表3土壤盆 處理植物高度根系的重量(cm)(mg)沙土No.1 A 24 945B 17 634No.2 A 18 866B 11 757粘土No.1 A 27 1095B 23 1213No.2 A 20 1012B 19 689在表4中給出沒有摻水的沙土和粘土(第2盆)的粉碎和斷裂程度。我們所指的粉碎程度是指分散在紙片上，而且不會在輕輕的振搖過程中碎裂的絕大部分土壤碎塊大小低于2mm(-)，2-5mm(+)，或大于5mm(++)。土壤表面的斷裂程度是如此標(biāo)記的沒有斷裂標(biāo)記為++，輕微斷裂標(biāo)記為+，出現(xiàn)較大裂縫，即干旱土壤的斷裂特征標(biāo)記為-。
表4土壤 處理粉碎程度 斷裂程度沙土 A++B--或+粘土 A++ +B++ ++從表3和表4的數(shù)據(jù)可以看出，生物合成多糖的微生物的存在可增進(jìn)植物的生長且有利于土壤結(jié)構(gòu)。
7B.野外實驗實驗是2000年時，以隨機(jī)區(qū)組排列的形式，在Improvement andCultivation Technological Station of MosonmagyaróvárUniversity進(jìn)行的，實驗重復(fù)4次，每公頃使用10升微生物混合物。
實驗土壤的類型多瑙河地區(qū)，厚度120-140cm，腐殖質(zhì)含量2.4％，降雨量較少。
春小麥



玉米



甜菜



實施例8本發(fā)明含微生物制品的制備8A，微生物混合物的制備將按照實施例6制備的巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/和白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B001301/的培養(yǎng)物混合，優(yōu)選等比混合，在一年之中的任何無霜凍期，優(yōu)選3-10月，以5-50升，優(yōu)選12升/公頃的量用于土壤中。
8B，處理單子葉植物的制品按照實施例6的方法，使用下列微生物制備不同的制品巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，白色鏈霉菌變種0003LP(NCAIM/P/B001301/。
8C，處理雙子葉植物的制品按照實施例6的方法，使用下列微生物制備不同的制品巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B001302/。
8D，制備冷凍干燥的制品按照設(shè)備的使用說明，將根據(jù)實施例6制備的2升微生物水混懸液在Gelman SP54冷凍干燥設(shè)備中進(jìn)行冷凍干燥。將干燥的微生物粉末單獨使用，或與碳酸鈣，淀粉，葡萄糖或纖維素以1∶1-1∶100的比例混合使用，然后將制品在4-10℃貯存?zhèn)溆谩?br> 8E，制備含載體的制品優(yōu)選將按照實施例6在培養(yǎng)基上制備的培養(yǎng)物與有機(jī)肥料，大豆粉(4目常規(guī)粒徑)，甲基纖維素或馬鈴薯淀粉等比混合，這樣所述制品應(yīng)含有5×108-1010，優(yōu)選5×109個微生物細(xì)胞，然后以2-20，優(yōu)選5kg/公頃的量將濕制品或在低于40℃的溫度干燥的制品用于所要處理的土壤中。優(yōu)選在每公頃土壤中摻入至少1130個微生物細(xì)胞。
總結(jié)本發(fā)明的主題是產(chǎn)品和使用細(xì)菌處理土壤，從而增進(jìn)植物生長，增加產(chǎn)率的方法，制備所述產(chǎn)品的方法，作為產(chǎn)品基礎(chǔ)的、可低溫繁殖并合成多糖的微生物的原液，以及用于生產(chǎn)它們的方法。可將本發(fā)明其中一種微生物細(xì)胞或它們的化合物運(yùn)送到土壤中，或固定在植物的種子中。
使用本發(fā)明的方法可將產(chǎn)品運(yùn)送到土壤中，所述產(chǎn)品含有至少一種土壤細(xì)菌，該土壤細(xì)菌可將空氣中的氮轉(zhuǎn)化成植物用的化合物，使礦化的磷-和鉀-化合物溶解，并生物合成可增進(jìn)植物生長的物質(zhì)，產(chǎn)生有利影響土壤結(jié)構(gòu)的多糖，它們是從各種土壤中分離并在實驗室中改變的，如此可達(dá)到令人滿意的產(chǎn)率，從而在實踐中不必使用高價肥料。
權(quán)利要求
1.適于處理土壤和植物種子的制品，它含有能夠在植物環(huán)境的不同土壤類型中繁殖的活的微生物，其特征在于它含有5×106-1011，優(yōu)選107-1010個細(xì)胞/g量的、微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色鏈霉菌變種0003 LP(NCAIM/P/B001301/中至少一種的培養(yǎng)物，以及從農(nóng)業(yè)觀點看為農(nóng)業(yè)上可接受的、而且對微生物無毒的濕載體或干載體，所述微生物在低溫，優(yōu)選低于20℃，以及低pH，優(yōu)選低于pH5.0的土壤中也繁殖，并保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制品，它含有水和/或大豆粉和/或淀粉和/或纖維素和/或葡萄糖或它們的衍生物作為載體。
3.用于制備適于處理土壤和植物種子的產(chǎn)品和/或含有活的微生物的制品的方法，所述微生物能夠在植物環(huán)境的不同土壤類型中繁殖，并且能夠在低溫，優(yōu)選低于20℃，和較低pH，優(yōu)選低于pH5.0時繁殖，其特征在于在含有碳源及氮源和無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，單獨或共同培養(yǎng)保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIMP/B 001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色鏈霉菌變種0003 LP(NCAIM/P/B 001301/中的至少一種，直到細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×107-5×109/毫升，任選以規(guī)定比例混合培養(yǎng)物，或任選使培養(yǎng)物沉積在載體上或與其混合，并任選按常規(guī)方式冷凍干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中使用葡萄糖和/或蔗糖和/或糖蜜作為碳源，氯化銨和/或硝酸銨和/或硫酸銨和/或玉米漿和/或酪蛋白-水解產(chǎn)物作為氮源，碳酸鈣和能夠解離出鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，鐵離子，硝酸根離子，氯離子，硫酸根離子，碳酸根離子，磷酸根離子，以及微量元素的鹽作為無機(jī)鹽。
5.優(yōu)選在低于20℃的溫度和pH5時也繁殖、并以以下保藏號保藏在國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細(xì)胞保藏中心的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B 001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/，大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色鏈霉菌變種0003 LP(NCAIM/P/B 001301/。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于制備微生物的方法，其特征在于從植物環(huán)境中給定土壤類型的40cm的上(頂)層采集土壤樣品，鑒定所選擇的微生物，使用突變劑進(jìn)行處理，并分離在低溫下也繁殖的變體。
7.使用權(quán)利要求1或2所述的制品處理土壤的方法，其特征在于在非霜凍期，以1010-1014，優(yōu)選1011-1012/公頃的量，將運(yùn)送微生物細(xì)胞施用于土壤上或土壤中。
8.使用權(quán)利要求1或2所述的制品處理植物種子的方法，其特征在于使用含有其中一種微生物或其混合物的液體產(chǎn)品處理種子。
9.用于改善或維持土壤結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于將微生物來源，優(yōu)選微生物合成succinoglucone的微生物來源的多糖運(yùn)送到土壤中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于施用能夠生物合成多糖的微生物，優(yōu)選含有菌株多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B 001292)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/或大豆慢生根瘤菌變種PH25(NCAIM/P/B 001302/的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及適于處理土壤的、含有活的微生物的產(chǎn)品，所述微生物可在不同的氣候和自然環(huán)境下繁殖，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的方法，此外還涉及使用該產(chǎn)品處理土壤和植物的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種從下列微生物的任何一種或其混合物制備所述產(chǎn)品的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)所用微生物的培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明的主題還有所述微生物本身。更具體而言，本發(fā)明涉及一種使用所述產(chǎn)品處理土壤和植物的方法，該產(chǎn)品含有微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B 001293)，維涅蘭德固氮菌M657(NCAIM/P/B001291)，熒光假單胞菌變種SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢桿菌變種SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢桿菌變種M326(NCAIM/P/B 001301/－中的至少一種，此外含有所列微生物的產(chǎn)品可在所討論的植物環(huán)境中繁殖并生存，本發(fā)明還涉及它們的生產(chǎn)方法。
文檔編號C05F11/08GK1568296SQ02820300
公開日2005年1月19日 申請日期2002年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者G·B·基斯, I·奧特 申請人:匈牙利農(nóng)業(yè)－生物公司