專利名稱：一種枸杞同源四倍體的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枸杞多倍體的育種方法，尤其是涉及一種枸杞同源四倍體的育種方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中，枸杞同源四倍體通常是利用誘變劑如秋水仙素處理枸杞種子或枸杞實生苗生長點或枸杞莖尖使其染色體加倍后培植得到的，這種方法的缺點是(1)誘變頻率低，如用誘變劑處理枸杞種子，其胚根細(xì)胞染色體加倍，但其成苗后莖尖經(jīng)鏡檢無加倍細(xì)胞，處理枸杞實生苗生長點誘變頻率僅為1/130-200；(2)育種周期長，以處理枸杞實生苗生長點誘變多倍體的方法為例，從播種、誘變、觀察、鏡檢到確定為枸杞同源多倍體需兩年以上時間；(3)優(yōu)選率低，由于事先不知誘變材料本身的遺傳性狀，因而優(yōu)選率低；(4)由于利用上述方法誘導(dǎo)枸杞同源四倍體出現(xiàn)嵌合體的頻率高，因而很難獲得純同源四倍體株系。
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種誘變頻率高，育種周期短，優(yōu)選率高，實用效果好且能獲得純枸杞同源四倍體的育種方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種枸杞同源四倍體的育種方法，其特征在于，包括以下過程a．優(yōu)良枸杞無性系愈傷組織的誘導(dǎo)將優(yōu)良無性系枸杞葉片消毒后，切成塊，接種在含6-芐基氨基嘌呤(6-BA)和吲哚-3-乙酸(IAA)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b．枸杞同源四倍體的誘導(dǎo)將上述培養(yǎng)好的愈傷組織用秋水仙素進(jìn)行染色體加倍處理；c．枸杞同源四倍體植株培養(yǎng)將上述處理后的愈傷組織接種在含6-芐基氨基嘌呤(6-BA)和吲哚-3-乙酸(IAA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成苗后，鏡檢，確認(rèn)為四倍體的植株擴(kuò)繁，上述a過程和c過程的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度26-30℃，光照1800-2200勒克斯(LX)下，每天照射10-12h，培養(yǎng)時間為25-30天。
上述a過程中消毒程序為，先用70％酒精浸泡0.5-1分鐘，再用0.1％氯化汞(升汞Hgcl2)浸泡8-10分鐘，最后用無菌水沖洗。
上述b過程的誘導(dǎo)程序為將處理過的愈傷組織切割成小塊，放入培養(yǎng)皿中，該小塊的上部和下部均鋪設(shè)用0.2％的秋水仙素溶液浸透的脫脂棉，然后在無菌、黑暗條件下處理48h。
上述a和c過程中6-芐基氨基嘌呤(6-BA)用量為0.5-1.5mg/l，吲哚-3-乙酸(IAA)的用量為0.5-2.0mg/l。
上述a過程中6-芐基氨基嘌呤(6-BA)用量為1mg/l，吲哚-3-乙酸(IAA)的用量為0.5mg/l。
上述c過程中6-芐基氨基嘌呤(6-BA)用量為0.5mg/l，吲哚-3-乙酸(IAA)的用量為1mg/l。
上述MS培養(yǎng)基用于一般組織培養(yǎng)。
本發(fā)明的枸杞同源四倍體的育種方法，由于在進(jìn)行染色體誘變加倍前，首先進(jìn)行優(yōu)質(zhì)愈傷組織的培養(yǎng)，從而提高了誘變率，試驗證明愈傷組織類型不同，其誘變頻率存在極顯著差異，如白色疏松型愈傷組織誘變頻率僅為2.3％，而淺綠色、質(zhì)地堅硬、表面無綠色芽點的愈傷組織誘變率高達(dá)97.5％；本技術(shù)手段所提供的同源四倍體的誘變條件，使得愈傷組織經(jīng)秋水仙素處理后受損程度降至最低，試驗證明，愈傷小塊在同樣濃度，同樣處理時間條件下，若浸泡在秋水仙素藥液中，處理后分化芽極少，有的整塊無分化能力，而采用該技術(shù)可使誘變苗木分化率提高63.7％；同時，由于將鏡檢與同源四倍體無性系的建立同步進(jìn)行，因而可提供純種的同源四倍體，縮短育種年限，如在無籽枸杞新品種99-3的選育中，作為親本之一的同源四倍體98-2是98年2月確定為純同源四倍體，3月份生根移栽，當(dāng)年7月中旬即開花、結(jié)果。
實施例采用優(yōu)良枸杞無性系的葉片用自來水沖洗3-4h，消毒70％酒精浸泡1min→0.1％升汞(Hgcl2)浸泡10min→用無菌水沖洗3-5次，將葉片縱向切開，再橫斷成小塊，接種在MS+6-BAlmgL-1+IAA0.5mgL-1培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度28℃，光照2000LX下，每天光照12h，培養(yǎng)30天，即可形成大量愈傷組織。
MS培養(yǎng)基用于一般組織培養(yǎng)，配方為單位為mg/l
選擇淡綠色，質(zhì)地緊密堅硬，表面無綠色芽點的愈傷組織，將其分割成0.5cm×0.5cm的小塊，放入經(jīng)高壓消毒過的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層用0.2％的秋水仙素浸透的脫脂棉，將愈傷組織小塊放在其上，然后用0.2％的秋水仙素浸透的脫脂棉覆蓋其上。在無菌，黑暗條件下處理48h后用無菌水沖洗3-4次，接種在MS+6-BA0.5mgL-1+IAA0.5mgL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如愈傷組織培養(yǎng)條件，25-30天即可誘導(dǎo)出小苗。
待苗高1.5-2cm時，將幼苗從基部取出，用幼葉(生長點周圍5-6片)和生長點做染色體檢查，其余部分單株接種在一瓶培養(yǎng)基中，檢查確認(rèn)為四倍體的擴(kuò)繁。
擴(kuò)繁采用MS+6-BA0.5mg/l+IAAI.5mg/l培養(yǎng)基，生根采用1/2MS+IBA(吲哚-3-丁酸)0.6mg/l培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)接種7天后生根，當(dāng)根長至0.5-1cm開始練苗移栽。移栽在營養(yǎng)缽中進(jìn)行，營養(yǎng)缽下部2/3為營養(yǎng)土，上端1/3為用0.2％多菌靈消毒過的蛭石。移栽后注意保濕、遮陰。25天后去掉塑料弓棚練苗，當(dāng)苗高長至10cm左右進(jìn)行大田綠苗移栽。
權(quán)利要求
1．一種枸杞同源四倍體的育種方法，其特征在于，包括以下過程a．優(yōu)良枸杞無性系愈傷組織的誘導(dǎo)將優(yōu)良無性系枸杞葉片消毒后，切成塊，接種在含6-芐基氨基嘌呤和吲哚-3-乙酸的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b．枸杞同源四倍體的誘導(dǎo)將上述培養(yǎng)好的愈傷組織用秋水仙素進(jìn)行染色體加倍處理；c．枸杞同源四倍體植株培養(yǎng)將上述處理后的愈傷組織接種在含6-芐基氨基嘌呤和吲哚-3-乙酸的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成苗后，鏡檢，確認(rèn)為四倍體的植株擴(kuò)繁，上述a過程和c過程的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度26-30℃，光照1800-2200勒克斯，每天照射10-12h，培養(yǎng)時間為25-30天。
2．按權(quán)利要求1所述的枸杞同源四倍體的育種方法，其特征是上述a過程中消毒程序為，先用70％酒精浸泡0.5-1分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡8-10分鐘，最后用無菌水沖洗。
3．按權(quán)利要求1所述的枸杞同源四倍體的育種方法，其特征是上述b過程的誘導(dǎo)程序為將處理過的愈傷組織切割成小塊，放入培養(yǎng)皿中，該小塊的上部和下部均鋪設(shè)用0.2％的秋水仙素溶液浸透的脫脂棉，然后在無菌、黑暗條件下處理48h。
4．按權(quán)利要求1、2或3所述的枸杞同源四倍體的育種方法，其特征是上述a和c過程中6-芐基氨基嘌呤用量為0.5-1.5mg/l，吲哚-3-乙酸的用量為0.5-2.0mg/l。
5．按權(quán)利要求4所述的枸杞同源四倍體的育種方法，其特征是上述a過程中6-芐基氨基嘌呤用量為1mg/l，吲哚-3-乙酸的用量為0.5mg/l。
6.按權(quán)利要求4所述的枸杞同源四倍體的育種方法，其特征是上述c過程中6-芐基氨基嘌呤用量為0.5mg/l，吲哚-3-乙酸的用量為1mg/l。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枸杞同源四倍體的育種方法,它包括以下過程:a.優(yōu)良枸杞無性系愈傷組織的誘導(dǎo):將優(yōu)良無性系枸杞葉片消毒后,切成塊,接種在含6－芐基氨基嘌呤和吲哚－3－乙酸的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng);b.枸杞同源四倍體的誘導(dǎo):將上述培養(yǎng)好的愈傷組織用秋水仙素進(jìn)行染色體加倍處理;c.枸杞同源四倍體植株培養(yǎng):將上述處理后的愈傷組織接種在含6－芐基氨基嘌呤和吲哚－3－乙酸的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng),成苗后,鏡檢,確認(rèn)為四倍體的植株擴(kuò)繁,上述a過程和c過程的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26－30℃,光照1800－2200勒克斯,每天照射10－12h,培養(yǎng)時間為25－30天。該方法具有誘變率高,優(yōu)選率高等優(yōu)點,并且能夠迅速繁育苗木,縮短育種年限。
文檔編號A01H4/00GK1313027SQ01111148
公開日2001年9月19日 申請日期2001年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者李健, 王錦秀 申請人:寧夏林業(yè)研究所(有限公司)