專利名稱:植物活化劑及其制備方法,活化方法、活性促進(jìn)劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及植物活化劑及其制備方法,其目的是從哈茨木霉SK-5-5(Trichoderma hurzianum SK-5-5)菌的培養(yǎng)基提取物中獲得具有抗絲狀菌及細(xì)菌性的物質(zhì)。
另外,涉及植物的活化方法及植物的活性促進(jìn)劑及其使用方法,其目的是通過哈茨木霉菌SK-5-5分生孢子的生成物給予植物的根、莖、葉等對病原菌的抵抗性。
近來大力提倡降低農(nóng)藥保全生態(tài)系統(tǒng)的病害防治策略,特別是,由于考慮到生物防治方法對環(huán)境負(fù)荷的影響要小,所以進(jìn)行了努力研究。
將從植物的根和根際分離出的細(xì)菌和真菌中有植物生長促進(jìn)作用的菌分別稱之為植物生長促進(jìn)根部菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)、植物生長促進(jìn)真菌(plant growth-promotingfungi,PGPF)。
已知上述根際微生物PGPR和PGPF不僅促進(jìn)植物的生長,而且抑制各種土壤病害。另外,最近有事實(shí)表明它們不僅可抑制土壤病害而且可抑制地上病害,上述PGPR和PGPF與誘導(dǎo)植物全身的抵抗性相關(guān)(1999年6月,《今月の農(nóng)業(yè)》)。
另外有報道表明,從朝鮮矮草(コウラ亻氵バ)分離篩選出的基點(diǎn)霉(Phoma)、木霉菌屬、鐮刀菌屬、青霉屬、Sterile等菌誘導(dǎo)黃瓜對炭疽病的抵抗性(1999年6月,《今月の農(nóng)業(yè)》)。
本發(fā)明以獲得對植物病原菌有抗菌性的物質(zhì)為課題進(jìn)行了研究,從北海道十勝地方的土壤中分離出Trichoderma hurzianum SK-5-5(哈茨木霉SK-5-5)。該菌對占植物病原菌80%的土壤傳染性病原絲狀菌有廣泛的拮抗性,現(xiàn)在作為矮草(芝)的ブラウンバツチ、ラ-ジバツチ等抗絲核菌(Rhizoctonia)類微生物農(nóng)藥(活菌制劑)正在開發(fā)中。上述哈茨木霉菌的拮抗作用是通過互相接觸菌絲發(fā)生共連接,促使細(xì)胞質(zhì)凝集而使之死亡的。從其外在觀察經(jīng)過看,并沒有如青霉菌(Penicillium sp)等生產(chǎn)的抗生素那樣在培養(yǎng)基上顯示抑菌圈那么高的活性,推測是菌絲間接觸而表達(dá)的物質(zhì)。
認(rèn)為上述細(xì)胞質(zhì)凝集作用是由哈茨木霉菌SK-5-5生產(chǎn)的什么物質(zhì)所引起的,對此進(jìn)行研究證明,將之作為第一目標(biāo)。
本發(fā)明中所使用的哈茨木霉菌SK-5-5株保藏于日本國通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號)(生命研),保藏號為“微工研菌寄第13327號”(保藏日1992年12月9日;保藏者株式會社北海道綠興產(chǎn))。根據(jù)布達(dá)佩斯條約由原保藏轉(zhuǎn)移到保藏的請求是在1992年12月9日進(jìn)行的,保藏號為BP-4346。
因?yàn)橐酝腜GPR和PGPF對炭疽病的有效性限于特定植物(例如黃瓜),所以今后的研究結(jié)果是,通過改善其使用方法等,判斷其對其它植物、病原菌有效的可能性,所針對的具體植物、病原菌是今后的課題。
但是以往生物農(nóng)藥的思考模式是僅僅殺滅病原菌,應(yīng)該向賦予的抵抗性波及到植物根莖這樣的方向轉(zhuǎn)變,這包含今后植物栽培上重要的提示。
本發(fā)明對哈茨木霉菌株SK-5-5反復(fù)進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的過程中,想到了要與上述生物農(nóng)藥的將來性一致,還選定、研究了使用方法、對象植物等,完成了本發(fā)明。本發(fā)明非常有望對將來植物栽培產(chǎn)生很大的影響,無疑是支持將來農(nóng)業(yè)的重要手段之一。
另外,本發(fā)明通過在植物栽培時,讓哈茨木霉菌SK-5-5的分生孢子共存于土壤中使之增殖,可以確認(rèn)其生成物賦予各種植物的根莖活性、提高其耐菌性,本發(fā)明發(fā)展改善了以往存在的問題,確立了其實(shí)用性。
即,有關(guān)活化劑的發(fā)明是,植物活化劑,其特征為用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)哈茨木霉菌SK-5-5,提取物為對絲狀菌具有抵抗性。另外,另一發(fā)明是植物活化劑,其特征為用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)哈茨木霉菌SK-5-5,提取物對細(xì)菌的一種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 209p)具有抗菌力。
有關(guān)制備方法的發(fā)明是植物活化劑的制備方法,其特征為將哈茨木霉菌SK-5-5接種到固體培養(yǎng)基上,25-30℃靜置培養(yǎng)7-15天以后,抽提,得到上述活性劑。還有,植物活化劑的制備方法,其特征為將哈茨木霉菌SK-5-5接種到液體培養(yǎng)基上,25-30℃靜置培養(yǎng)4-10天以后,抽提,得到上述活性劑。
本發(fā)明中所使用的固體培養(yǎng)基為米培養(yǎng)基。米培養(yǎng)基是由米100%,大豆粕3%,滅菌水10%構(gòu)成的固體培養(yǎng)基,為了不讓培養(yǎng)中培養(yǎng)基表面干燥,添加了滅菌水。
本發(fā)明中所使用的液體培養(yǎng)基為葡萄糖3%-5%,聚胨0.5%,NaCl 0.8%,酵母提取物0.2%,碳酸鈣1.0%。
上述固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基具有各自的特性,可生成不同的物質(zhì)。產(chǎn)生該結(jié)果的機(jī)制尚不清楚,仔細(xì)考慮是由于對哈茨木霉菌SK-5-5刺激及其它作用的不同且與培養(yǎng)基構(gòu)成物質(zhì)相關(guān)的特性,而生成不同的物質(zhì),充分研究用上述米培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基之外成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)也可生成同樣的物質(zhì),而且提高生成效率等今后的研究課題很多。
活化方法的發(fā)明是植物活化方法,其特征為栽培植物時施加哈茨木霉菌SK-5-5分生孢子的施用手段,使之共存于賦予上述植物活性的土壤中;植物活化方法,栽培植物時施加哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的施用手段,使之共存于賦予上述植物活性的土壤中,發(fā)生增殖,持續(xù)生成對絲狀菌具有抗菌力的物質(zhì)的植物活化方法。另外,特征為栽培植物時施加哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的施用手段,使之共存于賦予上述植物活性的土壤中,同時施加上述分生孢子增殖促進(jìn)條件的植物活化方法,分生孢子的施用手段為植物的種子處理、土壤和分生孢子的混和、分生孢子的撒布、灌水或埋沒等。再者,增殖促進(jìn)條件為土壤溫度15-30℃、水分30%以上的條件;其它的增殖促進(jìn)條件為給土壤賦予可增殖的通氣性或含氣性。
其它發(fā)明是植物活化促進(jìn)劑,其特征為將哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子附著到多孔性陶瓷粒子等其它載體上;植物活化促進(jìn)劑,其特征為將哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子與無菌處理的無機(jī)粒子混和,或?qū)⒐哪久筍K-5-5菌分生孢子附著到無機(jī)粒子,使上述無機(jī)粒子與其它粒子混和。另外,植物活化促進(jìn)劑,其特征為培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5菌的分生孢子,將之與培養(yǎng)基一起適量等份分離,與營養(yǎng)成分(例如殼聚糖)一起附著到無菌的多孔質(zhì)粒子上后,對每個包裝定量;植物活化促進(jìn)劑,其特征為用液體培養(yǎng)基使哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子增殖,與營養(yǎng)成分一起附著到無菌的多孔質(zhì)粒子上后,將多孔質(zhì)粒平均定量包裝。
其它的發(fā)明是,植物活化促進(jìn)劑的使用方法,其特征為將上述植物活化促進(jìn)劑混入育苗土壤中,或育苗時將之撒布到土壤中或撒布到苗圃中。此時,活化促進(jìn)劑的使用量為每1平方米撒布5g-100g 5×104/g-5×109/g的哈茨木霉SK-5-5菌,或者每1立方米栽培土混入5g-100g。
上述發(fā)明中的植物為甜菜、甜瓜、玉米、水稻、甘藍(lán)和洋蔥等,確認(rèn)對采集根、莖、葉及果實(shí)的植物有何效果,明確其效果除收量增加、糖度增加外還有其它的作用。
上述發(fā)明中,培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子,檢測其分離純化產(chǎn)物時,根據(jù)UV吸收光譜、質(zhì)譜及NMR測定結(jié)果,判定為含Aib(α-氨基異丁酸,α-Aminoisobutyric acid)的多肽的肽醇(Peptibols)類。肽醇類抗生素的特征為氨基酸序列中含有α-氨基異丁酸(Aib),N末端為乙?;?,C末端為氨基醇鍵(多為苯丙氨醇(Phenylalaniol)基)。其純化產(chǎn)物有A成分、B成分、D成分,通過質(zhì)譜,推測其部分氨基酸序列如下,與已經(jīng)存在的肽醇類的氨基酸序列檢索的結(jié)果是,沒有與其結(jié)構(gòu)一致的物質(zhì),推測它為新型肽醇類。因?yàn)镋的氨基酸序列推測比較困難,所以不能判斷。
UV吸收波長4種成分均為末端吸收A成分=1933B成分=1949或1964D成分=1810E成分=1829推測結(jié)構(gòu)A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-……B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-……D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-……如前所述,生成物質(zhì)的氨基酸序列是新序列,由植物的根吸收,到達(dá)莖和葉,然后消失。因此,盡管不知收獲時植物的根、莖、葉是否均有殘留,但推測在最初(發(fā)芽以后的幼莖等)被植物吸收的階段,使植物的DNA發(fā)生什么變化或者殘留下來。不知為什么,一旦植物獲得抗菌性,不管其分化生成根、莖等,抗菌性能夠持續(xù)。因此,與賦予免疫性(活化)類似,在幼苗時或比較幼小的植物(基本上植物的增殖期)時施用,沒必要再使用,一旦具有活性,其效力能持續(xù)植物的一生。
本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子,在植物幼苗時期或在播種時期混入到覆土中,伴隨分生孢子的增殖,生成物質(zhì)也增加,被根吸收到達(dá)莖、葉,使整體活化(有如賦予免疫力),因此,即便當(dāng)采摘植物生長的根或果實(shí)時期(例如,播種后1-6個月),也能保持上述抗菌性。因此,許多植物均可通過一次處理(撒布及其它的手段)賦予其活性后,有效達(dá)到其目的。
本發(fā)明中分生孢子的載體是多孔陶瓷粒子(例如,麥飯石的粒子),它是在殼聚糖溶液中浸漬,將水蒸發(fā)而形成的。粒子的大小無特殊限制,為了處理容易,優(yōu)選直徑為0.5mm-5mm左右。上述載體不限定于多孔陶瓷粒子(天然或人工),可使用對分生孢子無不良影響的物質(zhì)。
將預(yù)先培養(yǎng)的哈茨木霉SK-5-5菌以5×104/g-5×109/g附著到上述多孔質(zhì)粘粒子上,使每1m2撒布5g-100g。此時,有時與水一起撒布,但灌水有時是為了供給水分時,有時是均等浸透分生孢子,使之在土壤中均勻分布。
當(dāng)上述哈茨木霉SK-5-5菌的量不足5×104/g時,若上述菌的繁殖未受到抑制,是會增殖的,但有時不知什么原因不發(fā)生增殖,這是一個目標(biāo)。但細(xì)菌的增殖因環(huán)境的不同而有顯著差異,所以通過使用后的環(huán)境整理,即便再少量(例如不滿5g)的菌,也要按植物的發(fā)育使之增殖,以得到必要量的生產(chǎn)物質(zhì)。
另一方面,菌量的上限在5×109/g以下時,不必要從上述生產(chǎn)物質(zhì)的關(guān)系進(jìn)行考慮。菌增殖條件較差時,要施用較高濃度,但不必要超過5×109/g。
本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌通常以分生孢子施用,但當(dāng)施用的環(huán)境惡劣(例如高溫時、寒冷時)時,優(yōu)選施用厚膜孢子。
用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基或其它培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌,抽提其生成物,將之以植物活化劑施用時,0.1-1g/m2是必要的。
另外,當(dāng)撒布分生孢子時,該分生孢子的增殖下限菌數(shù)(例如5×109/g)是必要的。
本發(fā)明的植物活化劑為菌時,只施用1次即可,到收獲前沒必要施用。這一點(diǎn)與普通農(nóng)藥不同,其機(jī)制不明,但推測可能對植物的DNA產(chǎn)生某種程度的影響,或生成物質(zhì)微量殘留到植物的根、莖、葉中,發(fā)揮上述特性。
上面在施用分生孢子時,在苗圃等中,分生孢子充分增殖,一旦達(dá)到飽和,分生孢子急速喪失活性,隨后消失。有時,可以認(rèn)為還有一部分分生孢子殘留,當(dāng)增殖條件良好時也可再度增殖。
用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌,分離、純化其生成物質(zhì)中的A、B、C、D、E成分,活性物質(zhì)為具有新型氨基酸序列的新物質(zhì),其分子量為A成分=192,B成分=206,C成分=168,D1=154,D2=220,推測該氨基酸及其附近物質(zhì)對植物的活化有效。
于是,通過在所設(shè)定的濃度(例如1g中5×105以上)以上施用哈茨木霉SK-5-5菌的分生孢子(混用到土壤中,或撒布到有根植物的根際中),可證實(shí)達(dá)到預(yù)期目的。大致按不同植物的最適成分或混用的比例即可。
于是,用傳統(tǒng)的方法大量培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5菌,抽提、純化其生成物質(zhì),可得到植物的活化劑。證明上述生成物質(zhì)為上述A成分、B成分、C成分、D成分和E成分。
上述發(fā)明對各種植物有效,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在水稻、玉米、甜菜、甜瓜、馬鈴薯、甘薯、草莓、洋蔥、甘藍(lán)等有效。
用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌時,可以看到如表2所示,它對絲狀菌顯示抗菌性。
用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌時,可以看到如表2所示,它對細(xì)菌有效。
根據(jù)本發(fā)明,在植物的發(fā)育初期,將哈茨木霉SK-5-5菌每適量混入到床土中,或通過發(fā)育時的撒布等施用到根際,可活化植物,改善其根、莖、葉,防止罹患疾病,對病原菌產(chǎn)生耐性。這樣不僅可大大減少發(fā)育時期的發(fā)病,而且有促進(jìn)植物的發(fā)育,提高收成,增加糖度等多種效果。
但上述效果推測是哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的生成物質(zhì)(例如,新型氨基酸)所致,由于看到上述分生孢子在增殖后,或上述生成物質(zhì),到植物的成長終期有些消失,無任何有意義的影響,且連續(xù)使用也未見到任何不良影響。再者,因?yàn)榭吹缴鲜錾晌镔|(zhì)為新型氨基酸及其周邊物質(zhì),所以微量殘留到植物的葉莖也無害。
另外,可以看到這樣的特性由于本發(fā)明的哈茨木霉SK-5-5菌在土壤中增殖,當(dāng)環(huán)境條件適于增殖時,即使當(dāng)初撒布濃度不足時,通過補(bǔ)給增殖產(chǎn)生的必要量的生成物質(zhì)也可達(dá)到預(yù)期目的,然后自然消失。不必說對人體的影響,對土壤、植物及其它環(huán)境破壞的憂慮皆無。再者可以預(yù)測,對連續(xù)栽培不良的作物也能解除其連續(xù)栽培帶來的不利影響。
圖2
圖1的放大圖。
圖3A成分的UV吸收波長圖。
圖4A成分的1H-NMR(CD3OD)。
圖5(a)(b)A成分的質(zhì)譜圖。
圖6B成分的UV吸收波長圖。
圖7
B成分的1H-NMR圖。
圖8(a)(b)B成分的質(zhì)譜圖。
圖9D成分的UV吸收波長圖。
圖10D成分的1H-NMR圖。
圖11(a)(b)D成分的質(zhì)譜圖。
圖12E成分的UV吸收波長圖。
圖13E成分的1H-NMR圖。
圖14(a)(b)E成分的質(zhì)譜圖。
圖15A成分的UV吸收波長圖。
圖16A成分的HPLC圖。
圖17
圖16檢測出的A峰的質(zhì)譜圖。
圖18B成分的UV吸收波長圖。
圖19B成分的HPLC圖。
圖20
圖19檢測出的A峰的質(zhì)譜。
圖21C成分的UV吸收波長圖。
圖22C成分的HPLC圖。
圖23圖22檢測出的A峰的質(zhì)譜圖。
圖24C成分的質(zhì)譜圖。
圖25C成分峰的1H-NMR(CD3OD)圖。
圖26C成分的結(jié)構(gòu)圖。
圖27D成分的UV吸收波長圖。
圖28D成分的HPLC圖。
圖29(a)表示UVλ230nm處檢測出的D1成分顯示圖。
(b)表示UV末端吸收的D1成分和RT差0.6處檢測出的D2成分的圖。
圖30(a)圖29檢測出的D1成分的質(zhì)譜圖。
(b)圖29檢測出的D2成分的質(zhì)譜圖。
圖31米培養(yǎng)基的培養(yǎng)提取物純化過程系統(tǒng)圖。
圖32B培養(yǎng)基I的培養(yǎng)提取物純化過程系統(tǒng)圖。
圖33新物質(zhì)(MW198)1、2、3的衍生物的結(jié)構(gòu)圖。
圖34施用于洋蔥時,越冬前的發(fā)育調(diào)查部分的說明圖。
圖35洋蔥鱗莖直徑和葉面積的相關(guān)圖。
斜面培養(yǎng)基的組成燕麥 5.0%蔗糖5.0%瓊脂1.0%28℃培養(yǎng)5天后,冷藏保存。
(培養(yǎng))培養(yǎng)用500ml三角燒瓶,用米培養(yǎng)基(A培養(yǎng)基)和液體培養(yǎng)基(B培養(yǎng)基I)2種。A培養(yǎng)基的條件是28℃靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)途中添加10ml滅菌水),B培養(yǎng)基I的培養(yǎng)是28℃下270rpm振蕩培養(yǎng)。
培養(yǎng)基組成A培養(yǎng)基米100%大豆粕3%滅菌水10%培養(yǎng)基組成 B培養(yǎng)基I葡萄糖5.0%聚胨 0.5%NaCl 0.8%酵母提取物0.2%碳酸鈣1.0%
(檢測方法)檢測均用紙盤平板法體外進(jìn)行,供試菌應(yīng)用下述菌。
(1)立枯絲核菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)用由PDA(Nissui)1.3%、氯霉素0.002%構(gòu)成的培養(yǎng)基作檢測用培養(yǎng)基。將用鉆孔器選出的絲核菌(Rhizoctonia)菌絲的前端涂到平板培養(yǎng)基的中央,放置到浸透了肉湯的紙盤中,觀察菌絲的伸長情況。
(2)灰葡萄孢Botrytis cinerea用土豆-提取物20.0%、蔗糖2.0%、瓊脂1.5%構(gòu)成的培養(yǎng)基作檢測用培養(yǎng)基。檢測是將樣品放到紙盤中風(fēng)干后,涂到平皿中,將平皿放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察紙盤周圍是否形成抑制環(huán)。
(3)抗菌譜檢測菌用下述檢測菌測定抗菌譜枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633Micrococcus luters ATCC6633金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P大腸埃希氏菌Escherichia coli NIHJ釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae SHY3白假絲酵母Candida albicans M9001偽熱帶假絲酵母Candida pseudotropicalis M9035新型隱球酵母Cryptococcus neoformans M9010漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii M9011三角酵母Trigonopsis variabilis M9031粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe M9025Hansenula schneggi IAM4269(培養(yǎng)方法)(1)A培養(yǎng)基培養(yǎng)方法立枯絲核菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)活性產(chǎn)物分離純化絲狀菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)的A培養(yǎng)基培養(yǎng)提取液中的活性物質(zhì)。
將米100g和大豆粕3g加入到1只含A培養(yǎng)基(米培養(yǎng)基1kg)500ml的三角燒瓶中,制備相同條件下的10份培養(yǎng)基。滅菌后用エ-ゼ接種霉菌,28℃靜置培養(yǎng)10天(為了使菌增殖良好,途中可振蕩燒瓶。另外,若培養(yǎng)基的表面干涸,添加滅菌水),然后加入2升50%丙酮水抽提。于是得到2升培養(yǎng)物50%丙酮的抽提液。
(2)B培養(yǎng)基培養(yǎng)方法金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P活性物分離純化細(xì)菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P的B培養(yǎng)基培養(yǎng)提取液中的活性物質(zhì)。
表1培養(yǎng)基討論 為了更多生產(chǎn)液體培養(yǎng)基B培養(yǎng)基I的抗細(xì)菌活性成分,對比研究培養(yǎng)基組成中氮源和碳源比例不同的I-IV 4種培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基用2只500ml三角燒瓶,培養(yǎng)5天后將培養(yǎng)液5倍濃縮,進(jìn)行測定。
(3)B培養(yǎng)基I培養(yǎng)方法根據(jù)培養(yǎng)基檢測的結(jié)果進(jìn)行用B培養(yǎng)基I的純化培養(yǎng)。
在500ml三角燒瓶中制備100mlB培養(yǎng)基(葡萄糖5.0%,聚胨0.5%,NaCl0.8%,酵母提取物0.2%,碳酸鈣1.0%)。滅菌后種植細(xì)菌,28℃振蕩培養(yǎng)5天。加入與1.5L培養(yǎng)液等量的丙酮,得到3L 50%丙酮提取液。
(純化方法)(1)A培養(yǎng)基培養(yǎng)提取物純化方法蒸去A培養(yǎng)基培養(yǎng)的2L 50%丙酮提取液的丙酮后,將其1L全部通過HP-20-Sephadex柱(60.0cm×4.5cmφ),使之吸附。用等量的水洗滌后,用等量的50%丙酮洗脫,然后用等量的100%丙酮洗脫。用檢測菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)分別測定各級分后,可以確認(rèn)活性物質(zhì)是在100%丙酮洗脫部分中。接著,將100%丙酮洗脫部分濃縮到1L,得到1098mg的粗純化物。將其中的100mg上展開劑為甲醇體系的LH-20柱(100.0cm×2.0cmφ)。測定級分,確認(rèn)為活性級分?;厥者@些活性級分,然后用硅膠TLC(乙酸乙酯∶醋酸∶水=5∶1∶1)展開,進(jìn)行鉬硫酸顯色反應(yīng)后,檢測出Rf=0.3附近的點(diǎn)。同時,在無活性級分的展開部分未檢測出這些點(diǎn)。由此可以推測,活性物質(zhì)為在Rf=0.3附近可檢測出的點(diǎn),再進(jìn)行純化。硅膠PTLC展開(乙醋酸∶醋酸∶水=5∶1∶1),甲醇抽提后,用HPLC進(jìn)行分離純化。用儀器分析對分離純化物進(jìn)行鑒定(圖31)。
(2)B培養(yǎng)基I培養(yǎng)提取物純化方法蒸去B培養(yǎng)基培養(yǎng)的3L 50%丙酮提取液的丙酮后(1.5L),將其1.5L全部通過活性炭吸附柱(60.0cm×2.0cmφ),使之吸附。用等量的水洗滌后,用等量的50%丙酮洗脫,然后用等量的100%丙酮洗脫。用檢測菌Staphylococcus aureus 209P分別測定各級分后,可以確認(rèn)活性物質(zhì)是在100%丙酮洗脫部分中。將100%丙酮洗脫部分濃縮到1.5L,用乙醋酸進(jìn)行分配抽提,然后過用甲醇作展開劑的LH-20,用HPLC進(jìn)行分離純化。用儀器分析對分離純化物進(jìn)行鑒定(圖32)。
(分離純化物的生物活性法)(1)A培養(yǎng)基分離純化物評價方法
4成分的生物評價法用由PDA(Nissui)1.3%、氯霉素0.002%構(gòu)成的培養(yǎng)基作檢測用培養(yǎng)基。將用鉆孔器選出的Rhizoctonia solani(AG-1IA)菌絲的前端涂到平板培養(yǎng)基的中央,放上浸透了大小經(jīng)過調(diào)整的分離物質(zhì)的紙片,觀察菌絲的伸長情況。(2)B培養(yǎng)基I純化物評價方法C成分的生物評價法(MW168)分離純化的C成分(MW168)為新物質(zhì),具有極單純的結(jié)構(gòu)。為了保持其作為母核的興趣,擴(kuò)大生物評價的范圍。(3)細(xì)菌屬的評價生物分析將加入了試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中,凝固。將含有樣品的紙片放到其上,37℃培養(yǎng)18小時后,確認(rèn)形成抑菌圈。(a)使用菌株使用Staphylococcus aureus 209P、Pseudomonas syringal(煙草野火病菌)、野油菜黃單胞菌柑橘致病變種XanthomonoasCampestris pv.Citri(柑橘潰瘍病)、歐文氏菌Erwinia sp.(梅潰瘍病)4菌株。(b)使用培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)中使用肉湯培養(yǎng)基(DIFCO),培養(yǎng)過夜后,稀釋到×102,將之以0.5%混到上層培養(yǎng)基中,菌測定培養(yǎng)基用MYCIN AGAR(ミクニ化學(xué))。上層--向MYCIN AGAR1.5%(ミクニ化學(xué))+肉湯2%培養(yǎng)基(DIFCO)中加入0.5%的培養(yǎng)過夜后,稀釋到102的培養(yǎng)液。下層--MYCIN AGAR(ミクニ化學(xué))(c)抗菌測定用調(diào)整成1000ppm,500ppm,250ppm的分離純化物浸透紙盤,風(fēng)干后放到平皿中,37℃培養(yǎng)18小時,觀察有無抑菌圈形成。(4)對葡萄球菌抗菌力(MIC)的測定
(a)使用菌株使用S.aureus 209P JC-1,第一代保存的臨床分離的金黃色葡萄球菌20株(MSSA,MRSA各10株)及標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli NIHJ JC-2共22株。
(b)使用的抗菌藥MW168,甲氧西林(DMPPC,注射用Staphcillin,批號FSB 19900ug/mg,萬有制藥),萬古霉素)(VCM,Lot.No.41HO457,10750 SIGMA)(c)使用培養(yǎng)基抗菌力測定中,使用Muller-Hinton agar(MIADifco),預(yù)培養(yǎng)用Muller-Hinton肉湯(MHBDifco)。
(d)抗菌力測定按照日本化學(xué)療法學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)法,用瓊脂平板稀釋法測定各藥物對使用菌株的最小發(fā)育抑制濃度(MIC)。將菌株涂到MHA上,37℃培養(yǎng)過夜,生長的菌落37℃在MHB上培養(yǎng)過夜,將其菌液稀釋100倍(只有E.coli稀釋1000倍),為接種菌液。
(結(jié)果)(1)測定菌的結(jié)果A培養(yǎng)基和B培養(yǎng)基I的培養(yǎng)液活性如表2所示。用下述測定菌測定抗菌譜。
表2 A培養(yǎng)基培養(yǎng)抽提液中的檢測結(jié)果是,觀察到Rhizoctoniasolani(AG-1IA)的菌絲避開A培養(yǎng)基培養(yǎng)抽提物的紙盤。推測該菌生成的A培養(yǎng)基培養(yǎng)液中的活性物質(zhì)為妨礙菌絲生長的物質(zhì)。因此,嘗試從A培養(yǎng)基培養(yǎng)液,以對Rhizoctonia solani(AG-1IA)具有抑制活性的物質(zhì)為指標(biāo)進(jìn)行分離純化。
另外,B培養(yǎng)基I的培養(yǎng)抽提液中的檢測結(jié)果是,對Botrytiscinerea、Rhizoctonia solani未發(fā)現(xiàn)活性,僅對細(xì)菌有抑菌圈形成。這表明,該菌具有拮抗作用以外的抗菌力,可能生成抗生素。尤其是,因?yàn)閷瘘S色葡萄球菌Staphylococus aureus 209P形成的抑菌圈很清楚,所以以對細(xì)菌Staphylococus aureus 209P的活性物質(zhì)為指標(biāo)對B培養(yǎng)基I進(jìn)行分離純化。A培養(yǎng)基培養(yǎng)物與B培養(yǎng)基I培養(yǎng)物的抗菌譜不同,考慮生成各個系統(tǒng)不同的物質(zhì)。分別對各活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化。
(2)培養(yǎng)結(jié)果(a)A培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果將10份A培養(yǎng)基(米培養(yǎng)基1kg)500ml的三角燒瓶28℃靜置培養(yǎng)10天,得到培養(yǎng)物的50%丙酮抽提液2L。(b)B培養(yǎng)基討論與培養(yǎng)結(jié)果表1所示的B培養(yǎng)基I和B培養(yǎng)基II中可見到活性,B培養(yǎng)基I中可見到較強(qiáng)活性的菌株,在缺少氮源的條件下能生成活性物質(zhì)。由此,用B培養(yǎng)基I28℃振蕩培養(yǎng)5天。
(3)純化結(jié)果(a)A培養(yǎng)基純化結(jié)果將硅膠PTLC處理后的活性級分作為粗純化物,用HPLC(含0.05%TFA的MeOH/H2O)進(jìn)行純度確定。分析是0-30分鐘0-100%甲醇的梯度,再從30分鐘開始用100%甲醇,以1ml/min的流速進(jìn)行。在RT(保留時間)32.5分(Fr65)檢測(
圖1)。雖然看起來是檢測出單一物質(zhì)的峰,但由放大可以看出存在多個峰(圖2)。RT從前到后的稱為A、B、C、D、E(圖2),其中分離純化了4種成分。分離純化物的量為,A成分7.2mg,B成分12.1mg,D成分3.5mg,E成分4.5mg。C峰的量很少,未進(jìn)行純化。(c)B培養(yǎng)基I純化結(jié)果通過對各級分的活性檢測確定Fr41-54具有活性,回收。用HPLC(含0.05%TFA的MeOH/H2O)進(jìn)行分取、分析,檢測出的峰的RT從前到后有A、B、C、D、E 5種成分。其中分離純化出C成分8.1mg。分析結(jié)果(4)儀器分析結(jié)果(a)A培養(yǎng)基分離純化物通過UV吸收光譜、質(zhì)譜和NMR測定結(jié)果(圖3-14)判斷是含有Aib(α-氨基異丁酸)多肽和肽醇類。肽醇類抗生素的特征是,其氨基酸序列中含有α-氨基異丁酸(Aib),N末端為乙?;?,C末端結(jié)合有氨基醇(多數(shù)為苯丙氨醇)。通過質(zhì)譜,A成分、B成分、D成分一部分的氨基酸序列如下所示,其部分結(jié)構(gòu)與已知的肽醇類氨基酸序列檢索的結(jié)果是,無一致的物質(zhì),所以推斷為新型肽醇類。因氨基酸序列推定困難,所以未判斷E的。
UV吸收波長4成分均為末端吸收(圖3、圖6、圖9、
圖12)A成分=1933(圖5)B成分=1949或1964(圖8)D成分=1810(
圖11)E成分=1829(
圖14)推定結(jié)構(gòu)A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......
B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......
D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-......(b)B培養(yǎng)基I(液體培養(yǎng)基)活性產(chǎn)物儀器分析的結(jié)果是C成分為分子量168(C8H8O4)的新型物質(zhì)。其它成分的分離純化非常困難,不可能進(jìn)行判斷,所以進(jìn)行了LC/MS。A成分的UV吸收波長為末端吸收(
圖15)。HPLC的條件是用Capcelpac C18 UG120(2×150mm)柱,1%醋酸∶乙腈=98∶2,流速0.2ml/min,加溫進(jìn)行。在RT 7.48分鐘檢測出A成分(
圖16)。對檢測出的級分進(jìn)行質(zhì)譜的結(jié)果是,A成分的分子量為192(
圖17)。對B成分進(jìn)行了同樣的分析,B成分的UV吸收波長也為末端吸收(
圖18),HPLC的RT為12.45分鐘(
圖19)。質(zhì)譜的結(jié)果是,分子量為206(圖20)。C成分是可進(jìn)行分離純化的級分。C成分的UV吸收波長為270nm(圖21),HPLC的RT為15.92分鐘(圖22)。質(zhì)譜的結(jié)果是,分子量為168(圖23、24)。另外,用溶劑CD3OD溶解,進(jìn)行NMR測定(圖25)、解析時,推測它是含有五元環(huán)、具有共價鍵的新型物質(zhì)。推測的結(jié)構(gòu)如圖26所示。D成分的UV吸收波長在230nm附近(圖27),HPLC的RT為30.28分鐘(圖28)。但再度進(jìn)行HPLC時,UV檢測器的波長在末端和230nm處進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn),RT差0.6分鐘,存在兩個成分(D1,D2)(圖29)。分別對其進(jìn)行質(zhì)譜,結(jié)果RT在先的成分UV吸收為230nm的分子量為154(D1)。RT遲0.6分鐘檢測出的成分的分子量為220(D2)(圖30)。將這些分子量明確的成分按分子量的大小進(jìn)行排序的話是154(D1)、168(C)、192(A)、206(B)、220(D2)。(5)生物評價結(jié)果(a)A培養(yǎng)基培養(yǎng)分離純化物生物評價結(jié)果4成分的生物評價結(jié)果從5000ppm開始稀釋,在5000ppm、2500ppm、1250ppm、625ppm測定A、B、C、D 4種成分。結(jié)果,A、E成分在1250ppm仍可抑制Rhizoctonia solani菌絲的伸長;B、D成分在625ppm仍可抑制Rhizoctonia solani菌絲的伸長。
(b)B培養(yǎng)基I培養(yǎng)分離純化物生物評價結(jié)果(i)細(xì)菌屬的評價結(jié)果從B培養(yǎng)物(MW168)對細(xì)菌有無抑菌圈形成的生物活性來考慮其有無抗菌力及抗菌力的強(qiáng)弱。
(ii)對葡萄球菌抗菌力(MIC)的測定結(jié)果如表3所示。如表3所示,該次測定的濃度中,B培養(yǎng)物(MW168)無抗菌力,說明它對葡萄球菌無抗菌力或抗菌力極弱。
表3
測定濃度 MW168 50~0.10μg/mlDMPP(甲氧西林)12.5~0.10μg/mlVCM(萬古霉素) 6.25~0.10μg/ml討論從A培養(yǎng)基培養(yǎng)物分離純化出的成分中分離出4種含Aib(α-氨基異丁酸)的肽醇系成分。木霉菌(Trichoderma)產(chǎn)生的肽醇類已經(jīng)有若干報道,但這次分離純化出的與這些物質(zhì)均不一致。另外,各成分的氨基酸序列分析的結(jié)果推定3種成分為新序列(只有E成分的序列測定不能進(jìn)行)。In vitro試驗(yàn)中,觀察到抑制立枯絲核菌Rhizoctonia solani(AG-11A)的菌絲。由此結(jié)果可以表明,該菌的米培養(yǎng)基抽提物中產(chǎn)生抑制立枯絲核菌Rhizoctonia solani(AG-11A)的菌絲伸長的物質(zhì)。雖然不能斷言,該菌的拮抗作用是通過與對手菌絲接觸而表達(dá)了促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)凝集使細(xì)胞死亡的物質(zhì),但可以表明該菌的米培養(yǎng)基抽提物中產(chǎn)生抑制菌絲伸長的物質(zhì)。
另外,由B培養(yǎng)基I培養(yǎng)而分離純化出的成分為MW168的新物質(zhì)(3-(3-羥基環(huán)戊烯-5-酮-2-基)-2-丙烯酸),實(shí)施的幾個生物活性測定中均無活性,或極弱。推測活性體為MW168的周邊化合物,MW168為活性物的副產(chǎn)物。另外,MW168周邊化合物的分子量為MW154,MW192,MW206,MW220,分子量的差異分別為14。這與1個甲基的分子量相同,可以認(rèn)為是甲基的增減造成活性的差異。另外,雖然MW168具有新型結(jié)構(gòu),但通過結(jié)構(gòu)檢索已報道了幾個類似的化合物。其中,與MW168結(jié)構(gòu)最接近(圖33)的是島取大學(xué)的PGR活性篩選中發(fā)現(xiàn)的,由絲狀菌變幻青霉Penicillium valiabile SOPP代謝而分離純化出的,用化學(xué)式C8H8O5(MW168)表示的新型物質(zhì),活性很弱。
實(shí)施例2在農(nóng)地中施用本發(fā)明的植物活性促進(jìn)劑時,其對銀河瓜(ぎんがメロン)的結(jié)果如下。
實(shí)施場所 北海道常呂郡訓(xùn)子府町彌生田川農(nóng)場實(shí)施期間 平成11年4月23日-同年7月29日實(shí)施條件 以50g/m2的比率將アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商標(biāo),下同)撒布到瓜地中。
將5×107/g分生孢子附著到直徑1-2mm的麥飯石上。試驗(yàn)區(qū)、對照區(qū)共200m2,兩區(qū)的不同僅在于有無アグロミツクSK-10的撒布。農(nóng)藥、追肥一切皆無。
上述アグロミツクSK-10于平成11年4月23日撒布,平成11年4月26日定苗,同年7月29日開始收獲。銀河瓜的平均重量和糖度如表4所示。
表4 ()內(nèi)為采收后10天的糖度調(diào)查經(jīng)過的特征(1)初期階段的特征根活力顯著,葉形大,莖粗,花大。
(2)中期階段的特征藤的狀態(tài)健壯,與對照區(qū)有很大的差異,不用說使用農(nóng)藥,什么均不用也沒有苗的枯萎、藤裂病、藤枯萎病的征兆。
(3)收獲時的特征果實(shí)大,形態(tài)飽滿,網(wǎng)粗,張力強(qiáng)。
(4)檢查食味,果實(shí)整體糖度均等,外皮緊密,果肉柔軟,糖分高,而且晾干后具有上等品味(與對照區(qū)的瓜的確有差異)。
(5)果實(shí)收獲后能保存相當(dāng)長的一段時期(對照區(qū)的1.5倍以上)。
實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)場所 明治制果株式會社生物科學(xué)研究所實(shí)施期間 平成11年4月-同年8月實(shí)施條件 4月6日播種4月8日-22日發(fā)芽、育苗5月7日定苗,撒布アグロミツクSK-102×107/g、30-40g/m26月4日-7日交配7月12日-23日收獲上述過程中適當(dāng)施肥、澆灌。按以上實(shí)施,得到表5的結(jié)果。
表5糖度 結(jié)果施用區(qū)的糖度高1.5%。通過施用SK-10可提高蔗糖含量,抑制葡萄糖、果糖等。施用SK-10一次可提高糖度是賦予根際通過相互作用轉(zhuǎn)變光合左右產(chǎn)物及其它活性的結(jié)果。實(shí)施例4將本發(fā)明的植物活化劑施用給甜菜時得到如下結(jié)果。實(shí)驗(yàn)場所 北海道斜里町朱丹實(shí)施期間 平成11年3月12日-同年10月7日實(shí)施條件 對約30kg罐上部土混和處理アグロミツクSK-55(哈茨木霉SK-5-5菌的商標(biāo))。分生孢子在2×108/g以上。對覆土進(jìn)行滅菌處理。為了使菌固定,在3月下旬-4月中旬每周灌溉一次。7月30日,將アグロミツクSK-55的100倍液與株元一起噴灑到葉面上,2L/m2。處理區(qū)與對照區(qū)的不同是,未進(jìn)行滅菌處理,未進(jìn)行アグロミツクSK-55的處理,施肥量、施肥方法及其它均相同。結(jié)果按上面進(jìn)行實(shí)施,平成10年7月29日收獲時得到表6的實(shí)際數(shù)值和表7的比率。
表6實(shí)際值
表7比例 按照上面的實(shí)施例,根重增加32%,糖量增加40%。因此,同一面積可增收40%,驚人的成果。
按照上面的實(shí)施例,從發(fā)芽時的混和到7月30日アグロミツクSK-55的撒布,可看到收獲量顯著提高,因此可以推測,アグロミツクSK-55通過活化甜菜的根莖,造成養(yǎng)分吸收等合理、且增強(qiáng),細(xì)胞分裂也順調(diào)。
應(yīng)用給甜菜時,可通過研究種子的處理、土壤混和、中間撒布等今后的使用量和時機(jī)使其優(yōu)越性突出。
實(shí)施例5將本發(fā)明的植物活化劑施用給水稻時得到如下結(jié)果。實(shí)驗(yàn)場所 北海道札幌市清田(佐佐木農(nóng)場)北海道夕張郡田仁町(樋山農(nóng)場)北海道雨龍郡北童町(高橋農(nóng)場)實(shí)施期間 平成11年5月6日-同年9月16日實(shí)施條件 品種名稱ほレのゆめ さらら397アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商標(biāo))撒布量 A… 50g/m2、分生孢子2×108/gB… 100g/m2、分生孢子2×108/g對照區(qū)撒布タチガレンエ-ス液,除追肥(傳統(tǒng)方法)之外,其它相同。
在上述條件下栽培水稻,得到表8(佐佐木農(nóng)場)、表9(樋山農(nóng)場)、表10(高橋農(nóng)場)的結(jié)果。
表8(佐佐木農(nóng)場) 品種名はレのゆめ墊坪/77株,收獲日平成11年9月2日表9(樋山農(nóng)場) 品種名さらら397,罐坪/80株,收獲日平成11年9月3日蛋白含有量少的味美。
表10(高橋農(nóng)場) 品種名さらら397墊坪/80株,收獲日平成11年9月16日按上述實(shí)施例,對于さらら397,蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)區(qū)低4-6點(diǎn),比支鏈淀粉有1-3點(diǎn)的差別(1點(diǎn)為0.5)。
測定味度時,平均為91.0。而測定市售的所謂的味道好的米時最高為88.0,是目前最高的味度。
根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行判斷,可以確認(rèn)它是通過活化水稻而避開病原菌、害蟲的低農(nóng)藥有機(jī)栽培法,其特征是不僅可通過調(diào)動植物本身的能力來改善味道,而且可增加收獲量(20-50%)。實(shí)施例6將本發(fā)明的植物活化劑施用給玉米時得到如下結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)場所明治制果株式會社生物科學(xué)研究所實(shí)施期間平成11年4月-同年8月30日使用菌アグロミツクSK-10(2×107/g)施用法發(fā)芽第2周撒布土壤、灌水150ml/pot施用說明以上述條件為基礎(chǔ),按表11設(shè)計的進(jìn)行。
表11 環(huán)境自然光(室外)、白天25-38℃、夜間25-28℃、地溫25-34℃按上述進(jìn)行栽培、收獲,得到表12的結(jié)果。
表12 如前所述,可看到果實(shí)肥大,糖度增加的效果。幾乎看不到因施用量的多少導(dǎo)致的顯著性差異。即施用量為20g/m2與200g/m2之間沒有差異。可以推測,施用給玉米時,通過發(fā)芽后施用1次使之活化后,可持續(xù)到收獲。
因此,通過アグロミツクSK-10生成的新氨基酸的量只要能充分賦予活性,其施用量即使在20g/m2以下也能充分發(fā)揮效力。
通過上述理由可知,土壤具有アグロミツクSK-10增殖所必要的條件時,即使在20g/m2以下也能充分發(fā)揮效力。也許由可能增殖條件的下限確定。于是考慮在發(fā)芽后一定時期,以アグロミツクSK-10的增殖條件為基礎(chǔ)培育玉米的方法。實(shí)施例7將アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商標(biāo))施用到洋蔥的育苗床土上,如下檢測其對苗及移栽后的發(fā)育促進(jìn)效果。(1)試驗(yàn)材料(a)供試種子未進(jìn)行超ハィゴ-ルド藥物處理的種子(b)供試材料アグロミツクSK-10(Trichoderma harzianum SK-5-5菌的5×108CFU的活菌劑,北海道綠興產(chǎn)株式會社提供)(c)供試場所千葉縣木更津市下郡今間(2)供試方法(a)苗床的準(zhǔn)備在千葉縣下的山砂土,用前面制備的栽培甜玉米的苗圃作育苗床。因?yàn)槭莗H6.0左右的弱酸性土壤,所以在撒布アグロミツクSK-10前15天施用消石灰50g/m2、成熟堆肥(牛糞為主的加入谷殼的堆肥)1kg、CDU20g,施肥、耕耘,兼調(diào)整pH。
(b)アグロミツクSK-10施用及方法施用日平成11年9月11日在播種4日前,將供試材料顆粒劑アグロミツクSK-10 50g/m2撒布到準(zhǔn)備的育苗床上,充分混和到表層3-5cm的深度,用自來水進(jìn)行灑水,注意土壤水分不要過濕(用手握時形成團(tuán)的潮濕程度,即增殖培養(yǎng)絲狀菌的最佳濕度條件)。
(c)播種及アグロミツクSK-10施用后的管理播種日平成11年9月15日因?yàn)榍锢匣夂?,高溫、干燥,所以木霉菌在育苗床上增殖、定著良好,為了使洋蔥出芽良好,要盡可能地將地溫保持在20-25℃,并且為了穩(wěn)定水分條件,兩區(qū)內(nèi)均鋪上2-3cm厚的黑麥秸,其上放上防寒紗。
洋蔥種子按條播在50cm內(nèi)播種70粒左右,覆土后,適當(dāng)灑水,直到開始出芽,按上述方法被覆。
出芽后除去麥秸,用寒冷紗條被覆1個月左右。除去上述紗條,準(zhǔn)備移栽,將與堆肥混和的CDU化肥20g/m2淺淺施用到條間。以苗大小為直徑0.5-0.6cm×葉長5-6cm的成熟苗為目標(biāo)進(jìn)行育苗。
(d)定苗定苗日平成11年11月7日(播種后第53天)苗圃的土壤為沖積土,是pH6.0左右的弱酸性土壤,甘薯后制作。將消石灰60kg/10a、完熟堆肥500kg、骨粉60kg、米粕60kg充分混和,作為堆肥,施用、耕耘。一周后,制作寬1米、3條井道的畦,將CDU 20kg和過磷酸鈣10kg與完熟堆肥300kg充分混和,溝渠施肥。按苗大小,將苗定為株間15cm。(3)調(diào)查結(jié)果(a)出芽及發(fā)育狀況在未處理區(qū)、處理區(qū)出芽情況幾乎無差異,一周后,在未處理區(qū)稍微有苗枯萎發(fā)生。其后的發(fā)育是,到第25天左右看不到差異,但通過除去紗條、追肥后(播種后第35天),處理區(qū)葉色濃密,目視生長旺盛,二者之間可觀察到差異。
(b)苗的生長調(diào)查(i)定苗前苗的生長情況調(diào)查日為平成11年11月7日(播種后第53天),詳細(xì)的數(shù)據(jù)如表13所示。好苗(大及中苗數(shù))處理區(qū)為78%,未處理區(qū)為65%。通過施用アグロミツクSK-10,好苗比率增加13%。沒有苗徑為0.7mm以上的苗。促進(jìn)效果如表13所示。アグロミツクSK-10處理區(qū)生長指數(shù)高,生長旺盛,根量也多。比較生長促進(jìn)率時發(fā)現(xiàn)SK-10處理區(qū)比未處理區(qū)增加27%。
(ii)定苗后苗的生長情況調(diào)查越冬前的生長情況。調(diào)查方法用圖34的方法進(jìn)行調(diào)查。
結(jié)果詳細(xì)的結(jié)果如表14所示。
アグロミツクSK-10處理區(qū)與未處理區(qū)相比,出葉數(shù)多0.4葉,生長促進(jìn)率為152.5%,鱗莖直徑的增加率為154.7%。通過目視觀察也能觀察到明顯的促進(jìn)效果。アグロミツクSK-10處理區(qū)與未處理區(qū)相比,根量多,根張力良好,土充分附著到根上,根毛多。另外,アグロミツクSK-10處理區(qū)可看到葉面積與鱗莖直徑的相關(guān)性(圖35、表15、表16)。
表13定苗前苗的生長情況(播種后第53天,50cm株間的株數(shù))
a)平均生長指數(shù)為苗顆數(shù)×指數(shù)的合計/合計顆數(shù)b)平均促進(jìn)率為平均生長指數(shù)/未處理區(qū)平均生長指數(shù)×100表14越冬前的生長情況(調(diào)查日平成11年12月23日)
表15處理區(qū)鱗莖徑與葉面積的相關(guān)系數(shù)
相關(guān)系數(shù)顯示5%顯著性(兩側(cè))表16
實(shí)施例8將アグロミツクSK-10施用到甘藍(lán)的育苗床土上,如下檢測其對苗及定苗后的發(fā)育促進(jìn)效果。(1)使用材料(a)供試種子未進(jìn)行藥物處理的種子(b)供試材料アグロミツクSK-10(Trichoderma harzianum SK-5-5菌的5×108CFU,北海道綠興產(chǎn)株式會社提供)(2)供試場所千葉縣成田市吉田農(nóng)場(3)施用概要(a)施用日平成11年9月15日(b)播種日平成11年9月19日(c)床土為將pH6.0左右的砂壤土調(diào)整為中性,散布消石灰50g/m2。2周前施用1kg/m2的完熟堆肥,施肥、耕耘。
播種前撒布50g/m2左右的アグロミツクSK-10。然后,與表層5cm的土壤混和,灑水3L/m2左右,達(dá)到土壤水分不過濕的程度(用手握成團(tuán)的程度)。(4)調(diào)查日平成11年12月23日(播種后94日)上述調(diào)查日中可以看到,處理區(qū)的葉色濃密,厚葉密實(shí),結(jié)球性迅速。
權(quán)利要求
1.植物活化劑,其特征在于,它是用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5而提取出的物質(zhì),對絲狀菌具有抗菌性。
2.植物活化劑,其特征在于,它是用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5而提取出的物質(zhì),對細(xì)菌的一種(金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209p)具有抗菌性。
3.權(quán)利要求1或2的植物活化劑,其特征在于,提取出的物質(zhì)為下述A成分、B成分、C成分和D成分,A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......,分子量192B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......,分子量206C成分 ……分子量168D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-......,分子量154或220
4.植物活化劑的制備方法,其特征在于,將哈茨木霉SK-5-5接種到固體培養(yǎng)基上,25-30℃靜置培養(yǎng)7-15天后,抽提,得到權(quán)利要求1的物質(zhì)。
5.植物活化劑的制備方法,其特征在于,將哈茨木霉SK-5-5接種到液體培養(yǎng)基上,25-30℃振蕩培養(yǎng)4-10天后,抽提,得到權(quán)利要求2的物質(zhì)。
6.植物活化的方法,其特征在于,栽培植物時,附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段,從而賦予上述植物活性。
7.植物活化的方法,其特征在于,栽培植物時,附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段,從而生成使上述植物活化的物質(zhì)。
8.植物活化的方法,其特征在于,栽培植物時,附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段,在生成使上述植物活化的物質(zhì)的同時,附加促進(jìn)上述分生孢子增殖的條件。
9.權(quán)利要求6、7、8任一項的植物活化的方法,其特征在于,分生孢子的施用手段是,將分生孢子附著到植物的種子上,將覆土與分生孢子混和,或撒布適量的分生孢子,灌溉水或埋沒。
10.權(quán)利要求8的植物活化的方法,其特征在于,增殖促進(jìn)條件是,土壤溫度15-30℃,水分30%以上。
11.權(quán)利要求7的植物活化的方法,其特征在于,增殖促進(jìn)條件是,賦予土壤增殖可能的通氣性或含氣性。
12.植物活化劑,其特征在于,將哈茨木霉SK-5-5的分生孢子附著到無菌處理的多孔性陶瓷及其它載體粒子上。
13.植物活化劑,其特征在于,將哈茨木霉SK-5-5的分生孢子與無菌處理的無機(jī)粒子混和,或?qū)⒏街薙K-5-5的無機(jī)粒子與其它粒子混和。
14.植物活化劑,其特征在于,培養(yǎng)哈茨木霉SK-5-5的分生孢子,與培養(yǎng)基一起將之平均適量分離,與無菌多孔性粒子及營養(yǎng)成分構(gòu)成的填料混和,然后定量平均分裝。
15.植物活化劑,其特征在于,用液體培養(yǎng)基使哈茨木霉SK-5-5的分生孢子增殖后,定量平均分裝。
16.植物活化劑的施用方法,其特征在于,將權(quán)利要求11、12、13任一項中的植物活化劑混入育苗土壤,或在育苗時散布到土壤中,或者散布到苗圃中。
17.權(quán)利要求16的植物活化劑施用方法,其特征在于,活化劑的用量是散布5×104/g-5×109/g的哈茨木霉SK-5-5菌5g-100g/m2,或按5g-100g/m3混入到栽培土壤中。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于以哈茨木霉SK-5-5(Trichoderma harzianumSK-5-5)菌的生成物賦予及促進(jìn)植物活性。將哈茨木霉SK-5-5以固體培養(yǎng)基培養(yǎng),提取出其生成物,或者施用上述菌的分生孢子,達(dá)到賦予及促進(jìn)植物活性的目的。
文檔編號A01N63/04GK1350541SQ00807600
公開日2002年5月22日 申請日期2000年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月8日
發(fā)明者佐佐木康晴 申請人:佐佐木康晴, 株式會社北海道綠興產(chǎn)